1. Добавить 200 мкл лизирующего раствора и хорошо перемешать на

вортексе, чтобы получить гомогенный раствор.

1. Инкубировать при 55 ° C в течение 10 минут.

2. Добавить 200 мкл 96-100% этанола в лизат и хорошо перемешать.

3. Извлечь колонку PureLink® Spin Column в сборную трубку из упаковки.

4. Добавить лизат (~ 640 мкл) в колонку PureLink®.

5. Центрифугировать колонку при 10000 об/мин в течение 1 минуты при комнатной температуре.

6. Удалить сборную трубку и поместить спин-колонку в чистую сборную трубку.

7. Добавить 500 мкл промывочного буфера 1, центрифугировать 1 минуту при 10000 об/мин.

8. Удалить сборную трубку и поместить спин-колонку в чистую сборную

трубку.

1. Добавить 500 мкл промывочного буфера 2 центрифугировать на максимальной скорости 3 минуты.

2. Удалить сборную трубку и поместить спин-колонку в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.

3. Добавить 50 мкл элюирующего раствора, пробирки инкубировать 1 мин. при комнатной температуре. Центрифугировать при максимальной скорости 1 минуту. Пробирка содержит очищенную геномную ДНК.

Если исследования с ДНК будут продолжены непосредственно после выделения, очищенную ДНК хранят в холодильнике при температуре 4 °C. Для более продолжительного хранения ДНК необходимо заморозить при температуре 20 °C.

Выделение ДНК методом осаждения на магнитных частицах. Использование магнитных твёрдых носителей в биохимических и молекулярнобиологических процессах имеет ряд преимуществ по сравнению с другими немагнитными методами выделения нуклеиновых кислот. Основной принцип заключается в том, что частицы, обладающие магнитным моментом, могут быть извлечены из раствора при наложении магнитного поля, например, при использовании постоянного магнита. Данный метод является быстрым, простым и эффективным для разделения частиц после связывания с нуклеиновыми кислотами или на стадии элюирования. Таким же образом можно изолировать компоненты разрушенных клеток, которые ингибируют ДНК-полимеразу в ПЦР. Основными ингибиторами ПЦР являются ионы кальция, полисахариды, фенольные соединения, гумусовые вещества, белки (коллаген, гемоглобин, иммуноглобулин) [305]. Ингибиторы могут находиться в биологическом материале, а могут быть добавлены в процессе обработки образца или выделения нуклеиновой кислоты. Такими веществами могут быть порошок из перчаток [305], различные соли (например, хлориды натрия и

калия), а также органические молекулы (например, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), этанол, изопропиловый спирт или фенол) [306].

Материалы для изготовления магнитных частиц различны: синтетические полимеры, пористое стекло или магнитные частицы из неорганических магнитных материалов, например, поверхностно-модифицированный оксид железа. Особенно популярными являются суперпарамагнитные частицы, которые не взаимодействуют между собой в отсутствии магнитного поля. Данные частицы будут магнититься только в магнитном поле, а после удаления из него будут терять магнетизм.

Для автоматического выделения нуклеиновых кислот используются магнитные частицы со стеклянным покрытием [307]. Метод удобен, технологичен и пригоден для подготовки образца к амплификации, его можно воспроизвести на роботизированных пипеттирующих рабочих станциях. Однако возможны потери продукта вследствие необратимой сорбции на носителе, а также в процессе многочисленных отмывок. Особенно большое значение это имеет при работе с небольшими количествами ДНК в образце [308].

Преимуществами автоматического выделения нуклеиновых кислот являются высокая скорость выделения нуклеиновых кислот, по сравнению с другими данный метод является менее трудоемким, высокие выход и чистота продукта, достоверность результата за счет исключения ошибок, связанных с человеческим фактором.

Выделение ДНК методом осаждения на магнитных частицах можно провести с помощью автоматизированной системы для выделения нуклеиновых кислот из клеток Automate Express DNA extraction system (рисунок 7), используя набор реагентов Charge Switch Forensic DNA Purification Kit (Life technologies, Invitrogen (рисунок 8)).

Выделение ДНК на автоматизированной системе Automate Express DNA extraction system коммерческим набором Charge Switch Forensic DNA Purification Kit

Состав набора:

• лизирующий буфер;

• протеиназа К;

• картриджи;

• наконечники;

• элюирующие пробирки;

• пробирки 1,5 мл.

Необходимое оборудование и материалы: ПЦР-бокс, водяная баня либо твердотельный термостат для микропробирок, вортекс (прибор для встряхивания и перемешивания), дозаторы с переменным объемом: 10-100 мкл и 200-1000 мкл), пробирки типа «Eppendorf» 1.5 мл, штативы для микропробирок, емкости для отходов.

Ход работы:

1. Установить водяную баню или термостат при температуре 55 ° С.

2. Подготовка лизис-микса: на каждый образец смешать 1 мл лизирующего буфера и 10 мкл протеиназы K.

3. Добавить 1 мл лизис-микса в пробирку.

4. Добавить биоматериал к лизис-миксу, убедившись, что образцы были полностью погружены в смесь; перемешивать в течение 10-15 секунд.

5. Инкубировать образцы в течение одного часа при температуре 55 ° C.

6. Удалить нерастворившийся материал одноразовым пинцетом или переместить лизат в новую пробирку.