Ход работы:

1. В реакционную смесь общим объемом 13 мкл вносят 1,3 мкл рестриктазного буфера (10x), 0,3 мкл рестриктазы SspI, 5 мкл ПЦР-продукта. Объем смеси доводят бидистилированной водой до 13 мкл.

2. Полученную смесь перемешать на вортексе и инкубировать в термостате в течение 16 часов при 37°С. Все операции проводить на лабораторном столе, ферменты либо поместить в лед, либо кратковременно извлекать из морозильной камеры.

3. Приготовить 2%-ный агарозный гель для проведения электрофореза.

4. Нанести на гель рестрикцированные образцы, маркер молекулярных масс. Продукты рестрикции разделить в готовом агарозном геле в течение 30 минут при напряжении 150 В.

5. Рассмотреть гель с помощью трансиллюминатора в УФ-свете.

Анализ полиморфизма нуклеотидной последовательности гена bGHR в восьмом экзоне проводился с помощью рестриктазы SspI . Рестриктаза SspI распознает Т→А транзицию в восьмом экзоне. Данная SNP вызывает подстановку полярного, хотя и незаряженного остатка тирозина вместо нейтрального фенилаланина в положении -279 белка. Сайтом узнавания для рестриктазы является последовательность ААТ↓АТТ. Разрезаемый ферментом амплификат содержит нуклеотид Т соответствующий аллелю bGHR -SspI^F [226]. В случае присутствия A-нуклеотида сайт рестрикции исчезает, такой аллель обозначен как bGHR -SspI^Y . Длина амплифицируемого фрагмента гена bGHR составляет 182 п.н. Длина фрагментов после рестрикции 158 и 24 п.н. На электрофореграмме могут быть видны варианты полос определенной длины, характерные для генотипов: одна полоса 182 п.н. (генотип bGHR -SspI^YY ), две полосы 158 и 24 п.н. (генотип bGHR -SspI^FF ); три полосы – 182, 158 и 24 п.н. (генотип bGHR -SspI^FY ). Фрагмент 24 п.н. на агарозном геле не визуализируется (рисунок 18).

Дорожка 1 – ПЦР-продукт 182 п.н. фрагмента гена bGHR -SspI;

Дорожки 2, 3, 4 – фрагмент рестрикции 158 п.н., соответствующий генотипу bGHR -SspI^FF ;

Дорожка 5 – фрагмент рестрикции 182 п.н., соответствующий генотипу bGHR -SspI^YY ;

Дорожка 6 – фрагменты рестрикции 182 и 158 п.н., соответствующие генотипу bGHR -SspI^FY . Фрагмент 24 п.н. не визуализируется. Использован маркер молекулярных масс O’Range Ruler^TM 50 bp DNA Ladder, Fermentas, Литва. Положение на геле специфических полос показано стрелками.

Рисунок 18 – Электрофореграмма ДНК-типирования полиморфизма bGHR -SspI

Контрольные вопросы

1. Денатурация – это: а) процесс образования двухцепочечных молекул из одиночных полинуклеотидных комплементарных цепей; б) расхождение цепей двуцепочечной молекулы ДНК или РНК; в) нарушение нативной конформации биологических макромолекул в результате разрушения нековалентных (водородных) связей; г) удлинение нуклеотидной цепи путем добавления новых нуклеотидов.

2. Составьте реакционную смесь по гену рецептора гормона роста (bGHR) , которая готовится в объеме 20 мкл и содержит 2 мкл 10х буфера, 2 мкл MgCL2, 0,25 мкл дНТФ (dNTP’s), 1,7 мкл каждого праймера, 0,3 мкл Taq-полимеразы, 1,5 мкл геномной ДНК.

3. Проведите постановку ПЦР, используя программу: горячий старт – 3 минуты при 95°С; 30 циклов: денатурация – 30 секунд при 95°С; отжиг – 30 секунд при 62°С; синтез – 30 секунд при 72°С; достройка – 10 минут при 72°С.

4. Проведите визуализацию амплификата по гену рецептора гормона роста методом горизонтального электрофореза. Детекция результатов амплификации по гену гормона роста: 5 мкл продукта амплификации + 0,5 мкл бромфенол голубого, раскапать в 1,5% агарозный гель (V=110, 30-35 мин.).

1. Проведите рестрикцию амплифицированного участка гена рецептора гормона роста. Для рестрикции амплифицированного участка гена bGH используют эндонуклеазу SspI. Реакцию проводят при температуре 37°С. Продукты рестрикции генов разделяют электрофоретически в 2% агарозном геле (при напряжении 150 В) 30 мин в ТВЕ буфере при УФ-свете с использованием бромистого этидия на системе гель-документирования.

3.4.4 Постановка ПЦР-ПДРФ гена инсулиноподобного фактора роста-1 ( bIGF-1 )

Проведение амплификации гена инсулиноподобного фактора роста-1 ( bIGF-1 )

Необходимые реактивы: пробы ДНК, 10х ПЦР-буфер, деоионизированная вода, хлорид магния, Taq-полимераза, дезоксинуклеозидтрифосфаты (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), праймеры для исследуемого участков гена bIGF-1.

Необходимое оборудование и материалы: ПЦР-бокс, вортекс, холодильник с морозильной камерой на –20°С, амплификатор, дозаторы с переменным объемом (0,1–10 мкл, 1–10 мкл, 10–100 мкл, 100–1 000 мкл), наконечники для дозаторов (0,1–10 мкл, 1–10 мкл, 10–100 мкл, 100–1 000 мкл), пробирки типа «Eppendorf» объемом 1,5 мл, микропробирки пластиковые с плоской крышкой типа «Eppendorf» объемом 0,2 или 0,5 мл соответственно амплификатору, штативы для микропробирок, спирт для обработки столешницы и инструментов, емкости для отходов.

Ход работы:

1. Для установления генотипов крупного рогатого скота по локусу гормона роста используют следующие праймеры

SnaBI-F: 5′-attcaaagctgcctgcccc-3′;

SnaBI-R: 5′-acacgtatgaaaggaact-3′ [312].

1. Приготовить реакционную смесь для проведения ПЦР. Смесь без ДНК матрицы приготовить в одной пробирке и затем аликвотировать по индивидуальным.

На 1 реакцию понадобится 20 мкл реакционной смеси. Необходимо взять: – 0,25 мкл смеси dNTP;

• 2 мкл 10х ПЦР-буфера;

– 1,7 мкл прямого и 1,7 мкл обратного праймеров;

• 2 мкл хлорида магния;

• 0,3 мкл Taq-полимеразы;

• 10,55 мкл деионизованной воды.

Перемешать все компоненты. Taq-полимеразу добавить в последнюю очередь, вынув ее из морозильной камеры холодильника и поместив на лед.