3 - артефакты, обусловленные реагентами. Ошибки, связанные с особенностью Tag-полимеразы добавлять к 3´-концу не принадлежащий к последовательности амплифицируемого фрагмента нуклеотид (как правило, аденин). Эта реакция чувствительна к последовательности 5´-конца праймера и длительному времени элонгации в ПЦР. «Slippage» («запинание») Tagполимеразы на первых стадиях ПЦР приводит к появлению ложных аллелей. Реагенты низкого качества могут отрицательно влиять на условия ПЦР, неадекватные условия электрофореза могут приводить к искаженной картине распределения аллелей по размеру и т.д.

4 - человеческий фактор. Существенная доля ошибок ПЦР-ПДРФ обусловлена именно этим фактором [316. Так, это может быть связано с субъективностью оценки электрофореграмм и радиоавтограмм, и соответствующим некорректным обозначением аллелей, что в свою очередь зависит и от качества данных; загрязнение экзогенной ДНК или случайное перекрестное «заражение» образцов, использование неоптимальных протоколов, неоптимальных праймеров, температуры плавления в ПЦР, ошибки при вводе и обработке данных и др. [317]. На практике для выявления ошибок ПЦР-ПДРФ проводится повторная реакция амплификации и сравнение полученных продуктов первоначального и повторного анализа для определенного ряда образцов, другими словами – анализ дублированных образцов [318]

В свою очередь ошибки ПЦР-ПДРФ, возникающие при действии человеческого фактора, также условно можно разделить на три категории, соответствующие этапам анализа:

• Ошибки преаналитического этапа. Данный этап включает взятие биоматериала, его хранение и транспортировку, пробоподготовку. В первую очередь, необходимо правильно определить место взятия биологического материала для исследования. Второй распространенной ошибкой преаналитического этапа является неправильное взятие материала на исследование. При работе с кровью важно учитывать тот факт, что для предотвращения ее свертывания в процессе доставки необходимо использовать антикоагулянты. Однако, наиболее распространенный антикоагулянт – гепарин является мощным ингибитором ПЦР, поэтому его использование в данном случае недопустимо. Принципиальным для получения адекватных результатов ПЦР является хранение биологического материала. Необходимо помнить о температуре хранения биологического материала, а также сроках и способах его доставки в ПЦР-лабораторию в случае, если транспортировка требует значительного времени. При нарушении сроков хранения или транспортировки биоматериала ДНК или РНК могут разрушаться, что приведет к ложноотрицательным результатам. Образцы рекомендуется хранить при температуре от 2 до 8°С в течение 24-48 часов, для более длительного хранения необходимо замораживание.

- Ошибки аналитического этапа. Проведение собственно лабораторного исследования также может сопровождаться рядом ошибок, среди которых одной из основных является неправильный выбор системы пробоподготовки. Выбор метода выделения должен определяться характером биоматериала, степенью его загрязнения потенциальными ингибиторами ПЦР. Использование экспресс-методов существенно сокращает время пробоподготовки, делает минимальными потери ДНК в процессе выделения и существенно сокращает риск кросс-контаминации, что представляется весьма привлекательным для рутинного использования в лаборатории. Однако, существенным недостатком данной группы методов является низкая степень очистки пробы от ингибиторов, следствием чего 3-5% образцов дают недостоверные результаты в ПЦР. Сорбентные методы можно определить, как «универсальные», однако для них характерно длительное время выделения, что может привести к перекрестной контаминации; потери ДНК с сорбентом – выход ДНК напрямую зависит от качества сорбента.

• Ошибки постаналитического этапа. Основной проблемой постаналитического этапа является неверная интерпретация исследователем результатов ПЦР-ПДРФ анализа [319].

ПЦР-ПДРФ анализ связан с проблемой, обусловленной высокой чувствительностью метода, – возможностью контаминации.

Контаминация – попадание из внешней среды в реакционную смесь специфических и неспецифических молекул нуклеиновых кислот, способных служить мишенями в реакции амплификации и давать ложноположительные или ложноотрицательные результаты.

Сотрудник, занимающийся ПЦР-ПДРФ диагностикой, в своей работе сталкивается с тремя видами контаминации:

1. Перекрестная контаминация от пробы к пробе (в процессе обработки биоматериала или при раскапывании реакционной смеси), приводящая к появлению ложноположительных результатов.

2. Контаминация продуктами амплификации (ампликонами), имеющая наибольшее значение, поскольку в процессе ПЦР ампликоны накапливаются в огромных количествах и являются идеальными продуктами для реамплификации.

3. Контаминация следовыми количествами ампликонов посуды, автоматических пипеток и лабораторного оборудования, поверхностей лабораторных столов или даже поверхности кожи сотрудников лаборатории приводит к появлению систематических ложноположительных результатов.

Как правило, определить источник контаминации бывает очень трудно и требует значительных затрат времени и средств [320].

Основными правилами предотвращения контаминации в лаборатории являются:

• Разделение функциональных рабочих зон;

• Соблюдение поточности и направления движения анализируемых образцов;

• Отдельные лабораторные халаты в каждой рабочей зоне;

• Одноразовые перчатки без талька;

• Наконечники для дозаторов с фильтрами, защищающими от аэрозоля;

• Одноразовые пластиковые пробирки, посуда, наконечники;

• Химическая и УФ дезинфекция всех поверхностей рабочих зон.

Все три зоны должны быть изолированными комнатами, снабженными предбоксниками. Полезно иметь устройство фильтрации воздуха.

Кроме того, желательно предусмотреть отдельные помещения для переодевания и хранения верхней одежды, приема пищи, складское помещение для лабораторных материалов. Все производственные комнаты должны быть снабжены коротковолновыми ультрафиолетовыми лампами. Перемещение пробирок, штативов и пр. должно производиться только в направлении из «чистой» зоны в зоны пробоподготовки и детекции. Клинический материал, поступивший в лабораторию, должен быть как можно быстрее обработан в комнате пробоподготовки. В эту же комнату должны поступать пробирки с реакционной смесью из «чистой» зоны для внесения в них препаратов ДНК. После этого пробирки помещают в амплификатор и, по окончании термоциклирования, не открывая крышек, переносят в зону детекции. Все операции (пробоподготовка, подготовка реакционной смеси, электрофорез) должны выполнять разные люди [321].

Контрольные вопросы

1. На какие категории можно разделить ошибки проведения ПЦР-ПДРФ?

2. Появление ложноположительных результатов при попадании в пробирку следовых количеств положительной ДНК – это: а) кроссинговер; б) конъюгация; в) контаминация; г) корреляция

3. Основные принципы предотвращения контаминации при работе с биологическим материалом.

4. Условия хранения биологического материла.

5. Какие меры необходимо предпринять, если были выявлены ошибки

ПЦР-ПДРФ анализа?

3.6 Статистическая обработка данных для оценки эффективности маркеров

Объем производства продукции животноводства непосредственно определяется двумя показателями - численностью животных и их продуктивностью. При учете численности животных их дифференцируют по видам, породам, возрасту, полу, производственному назначению,