1. Запустить автоматизированную систему Automate Express DNA extraction system, включив кнопку питания.

2. Открыть дверцу инструмента (нажав на дверь); затем снять стойку для картриджа.

3. Загрузить картридж в стойку так, чтобы он защелкнулся. Необходимо убедиться в том, что выемки в картридже совпадают с вырезами в стойке для картриджей. Если необходимо обработать менее 13 образцов, можно оставить пустые слоты в стойке.

4. Загрузить пробирки с элюирующим раствором и пробирки для ДНК в

стойку:

• загрузить первый ряд (обозначенный как E) элюирующими пробирками;

• второй ряд (обозначенный как T1) оставить пустым;

• загрузить третий ряд (обозначенный как T2) наконечниками iPrep ™;

• загрузить четвертый ряд (обозначенный как S) пробирками без

• колпачков, содержащих лизат (~ 1 мл).

Если необходимо обработать менее 13 образцов, наконечники и пробирки загружают в тех же положениях, что и картриджи.

1. Вставить стойку с картриджами, а также стойку с наконечниками с пробирками в прибор Automate Express DNA extraction system. Закрыть дверцу инструмента.

2. Нажать «Пуск» на главном экране.

3. Убедиться, что отображается имя используемого набора реагентов

Charge Switch Forensic DNA Purification Kit.

1. Следовать инструкциям на экране, затем нажать «Старт».

2. В конце прогона инструмент подаст короткий звуковой сигнал.

3. Открыть дверцу инструмента. Удалить и закрыть элюирующие пробирки, содержащие очищенную нуклеиновую кислоту.

Если исследования с ДНК будут продолжены непосредственно после выделения, очищенную ДНК хранят в холодильнике при температуре 4 °C. Для более продолжительного хранения ДНК необходимо заморозить при температуре 20 °C.

Контрольные вопросы

• 1.Каковы принципы отбора биологического материала?

• Порядок взятия крови крупного рогатого скота.

• Каковы основные этапы выделения и очистки нуклеиновых кислот при

использовании колоночного метода?

4. Заполнить таблицу «Методы выделения ДНК»

1. Выделить ДНК из крови крупного рогатого скота колоночным методом.

70

3.2 Качественная и количественная оценка ДНК

Измерение концентрации нуклеиновых кислот является рутинной практикой во многих молекулярно-биологических лабораториях. Определение концентрации и качества препарата нуклеиновых кислот – один из ключевых начальных шагов в экспериментах, включающих ПЦР, секвенирование и др. Для оценки качества и концентрации нуклеиновых кислот в лабораторной практике используют качественные и количественные методы. Качественный метод оценки концентрации нуклеиновых кислот основан на проведении электрофоретического разделения в агарозном геле препарата нуклеиновой кислоты и контрольного образца с известной концентрацией (например, коммерческий маркер размерности ДНК). При этом для более точного определения количества нуклеиновой кислоты используют стандартное разведение контрольного образца. Качество ДНК оценивается по наличию четкого, или не четкого бэнда или его отсутствию. При отсутствии деградации ДНК выявляют четкую дискретную полосу. При наличии деградации той или иной степени на дорожке наблюдают несколько фрагментов ДНК различной молекулярной массы. При недостаточной очистке препарата ДНК от белковых фракций, на электрофореграмме наблюдается «шмер» ниже расположения полосы, соответствующей ДНК.

Достоинством этого метода является то, что кроме оценки наличия и концентрации выделенной ДНК имеется возможность установить величину фрагментов выделенной ДНК, т.е. оценить степень ее деградации. К недостаткам метода следует отнести относительно невысокую чувствительность метода, кроме того, при выделении ДНК из объектов, загрязненных бактериальной микрофлорой, не представляется возможным отличить ДНК животного от бактериальной ДНК, что может привести к ошибочному занижению количества ДНК, вносимого в реакционную смесь при постановке реакции амплификации, и соответственно к неудовлетворительному результату.

Проведение электрофореза на агарозном геле

Необходимые реактивы: агароза, ТБЕ-буфер, дистиллированная вода, краска для электрофореза

Необходимое оборудование и материалы: микроволновая печь, камера для горизонтального электрофореза, заливочный столик с гребенками, источник тока, трансиллюминатор для агарозно-этидиевых гелей, дозаторы с переменным объемом 2-10 мкл, наконечники для дозаторов объемом 2-10 мкл, мерный стакан объемом 100 мл, лента лабораторная «Parafilm M», спирт для обработки столешницы и инструментов, емкости для отходов.

Ход работы:

1. Приготовить 10 %-ный раствор ТБЕ-буфера. Для этого в мерный стакан на 100 мл налить 90 мл дистиллированной воды, добавить туда 10 мл ТБЕбуфера и хорошо перемешать.

2. Приготовить агарозу. К готовому раствору ТБЕ буфера добавить 0,5-1,5 г агарозы и перемешать. Гель варить в микроволновой печи при мощности 500 В – 1 мин (Не использовать фольгу в качестве крышки для стакана!!!) или на водяной бане, на плитке до полного растворения крупинок агарозы. При этом не допускается перегревание и закипание раствора.

3. Остудить гель до 60–50°С, добавить 8 мкл краски и залить в заливочную форму (как правило, размер геля 15×10 см), использовать гребенку, которая формирует карман объемом до 20 мкл.

4. Подготовить пробы ДНК – на ленту «Parafilm M», нанести 2 мкл красителя, к каплям красителя добавить 5 мкл ДНК, перемешать пипетированием.

5. После застывания геля пробы нанести в отдельные карманы. В одну лунку для контроля качества выделенной ДНК вносят маркер молекулярной массы «рGЕМ DNАmarker». Электрофорез проводить 15 мин при 80-100 В.

6. Рассмотреть гель с помощью трансиллюминатора в УФ-свете

В случае успешного проведения работы в трансиллюминаторе в УФ-лучах (290–330 нм) на электрофореограмме можно будет увидеть дорожки с продуктом гидролиза ДНК. Не включать трансиллюминатор без закрытого защитного щитка или очков во избежание во избежание ожога роговицы глаз.

Количественный (спектрофотометрический) метод оценки концентрации нуклеиновых кислот основан на их способности поглощать ультрафиолетовый свет при определенной длине волны. Белки и нуклеиновые кислоты поглощают свет в ультрафиолетовом спектре в пределах длин волн между 210 и 300 нм. Для определения количества ДНК или РНК измеряют поглощение раствора в областях с длинами волн 260 и 280 нм. Для оценки качества (содержания примесей) препарата нуклеиновых кислот используют отношение А260/А280, которое для чистого препарата ДНК приблизительно равно 1,8, а для РНК – примерно 2,0. Важно отметить тот факт, что примеси РНК в растворе ДНК не могут быть выявлены методом спектрофотометрии.

Современные спектрофотометры рассчитывают концентрацию нуклеиновых кислот автоматически с использованием специального программного обеспечения. В настоящее время существуют как обычные кюветные, так и спектрофотометры для микрообъёмов, позволяющие проводить измерения в объёмах 0,5-2,0 мкл. При этом измерение производится непосредственно в капле жидкости, которую наносят на неподвижный модуль прибора. Сверху на каплю опускают подвижный модуль прибора, в результате чего из образца формируется столбик жидкости между подвижным и