1. Приготовьте 2 % агарозный гель для проведения гель-электрофореза: – растворите 2 г агарозы в 100 мл 10 %-ном растворе 1хТВЕ. Нагрейте до 100 °С для растворения агарозы, постоянно перемешивая раствор, и медленно охладите до 40–50 °С. Добавьте в раствор агарозы бромистый этидий. Затем с помощью специальной кюветы и гребенки сформируйте гель с лунками.

2. Проведите визуализацию амплификата по гену каппа-казеина bCSN3 методом горизонтального электрофореза. Детекция результатов амплификации по гену bCSN3 : 8 мкл продукта амплификации + 0,5 мкл красителя раскапать в 2 % агарозный гель (110 W, 30–35 мин.). Длина амплифицированного фрагмента: 532 п.н. Для электрофореза используется 1хТВЕ буфер. Визуализация и анализ результатов осуществляются на системе гельдокументации.

3.3.2 Постановка ПЦР-ПДРФ для гена альфа-лактальбумина ( bLALBA )

Проведение амплификации гена альфа-лактальбумина ( bLALBA )

Необходимые реактивы: пробы ДНК, буферный раствор, деоионизированная вода, хлорид магния, Taq-полимераза, дезоксинуклеозидтрифосфаты (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), праймеры для исследуемого участков гена bLALBA .

Необходимое оборудование и материалы: ПЦР-бокс, вортекс, холодильник с морозильной камерой на –20°С, амплификатор, дозаторы с переменным объемом (0,1–10 мкл, 1–10 мкл, 10–100 мкл, 100–1 000 мкл), наконечники для дозаторов (0,1–10 мкл, 1–10 мкл, 10–100 мкл, 100–1 000 мкл), пробирки типа «Eppendorf» объемом 1,5 мл, микропробирки пластиковые с плоской крышкой типа «Eppendorf» объемом 0,2 или 0,5 мл соответственно амплификатору, штативы для микропробирок, спирт для обработки столешницы и инструментов, емкости для отходов.

Ход работы:

1. Для установления генотипов крупного рогатого скота по локусу альфалактальбумина используют следующие праймеры

ALF-LAC1: 5′- aagagttggatggaatcacc -3′;

ALF-LAC2: 5′- ttcaaattgctggcatcaagc -3′ [52].

1. Приготовить реакционную смесь для проведения ПЦР. Смесь без ДНК матрицы приготовить в одной пробирке и затем аликвотировать по индивидуальным.

На 1 реакцию понадобится 20 мкл реакционной смеси. Необходимо взять:

– 2 мкл смеси dNTP;

– 2 мкл реакционного буфера;

• 1 мкл прямого и 1 мкл обратного праймеров;

• 2 мкл хлорида магния;

• 0,4 мкл Taq-полимеразы;

• 10,9 мкл деионизованной воды.

Перемешать все компоненты. Taq-полимеразу добавить в последнюю очередь, вынув ее из морозильной камеры холодильника и поместив на лед.

1. Полученную реакционную смесь раскапать в подготовленные пробирки.

2. Добавить в каждую пробирку, кроме пробирки с отрицательным контролем, по 2 мкл матричной ДНК.

3. Поместить пробирки в амплификатор и запустить соответствующий режим, который должен соответствовать праймерам, используемым в реакции. Режим амплификации:

1 94°С – 5 мин;

1. 94°С – 60 с;

2. 63°С – 60 с;

3. 72°С – 60 с;

4. Стадии 2–4 повторяются 30 раз;

5. 72°С – 10 мин.

6. Если образцы не анализируются сразу после окончания амплификации, их следует поместить в холодильник на –20°С.

Рестрикционный анализ гена альфа-лактальбумина ( bLALBA )

Необходимые реактивы: амплификат, рестриктаза Sdu1, 10х рестрикционный буфер, бидистиллированная вода, 6×DNA Loading Dye (краситель – 6×MassRuler™, раствор с красителями для нанесения образцов на гель), раствор бромистого 10 мг/мл этидия, маркер молекулярных масс 50 п.н. DNA Ladder (Fermentas), агароза, 10×ТБЕ буфер

Необходимое оборудование и материалы: ПЦР-бокс, вортекс, камера для электрофореза, заливочный столик с гребенками, микроволновая печь или плитка, источник тока, трансиллюминатор для агарозно-этидиевых гелей, холодильник с морозильной камерой на –20°С, амплификатор, дозаторы с переменным объемом (0,1–10 мкл, 1–10 мкл, 10–100 мкл, 100–1 000 мкл), наконечники для дозаторов (0,1–10 мкл, 1–10 мкл, 10–100 мкл, 100–1 000 мкл), мерный стакан (100 мл – 1 шт., 1000 мл – 1 шт.), пробирки типа «Eppendorf» объемом 1,5 мл, микропробирки пластиковые с плоской крышкой типа «Eppendorf» объемом 0,2 или 0,5 мл соответственно амплификатору, штативы для микропробирок, лента лабораторная «Parafilm M», спирт для обработки столешницы и инструментов, емкости для отходов.

Ход работы:

1. В реакционную смесь общим объемом 20 мкл вносят 2мкл 10х буфера для рестриктазы Sdu1, 1 мкл фермента Sdu1, 8 мкл амплификата. Объем смеси доводят бидистилированной водой до 20 мкл.

2. Полученную смесь перемешать на вортексе и инкубировать в термостате в течение 8 часов при 37°С. Все операции проводить на лабораторном столе, фременты либо поместить в лед, либо кратковременно извлекать из морозильной камеры.

3. Приготовить 2%-ный агарозный гель для проведения электрофореза.

4. Нанести на гель рестрикцированные образцы, маркер молекулярных масс. Продукты рестрикции разделить в готовом агарозном геле в течение 2-х часов при напряжении 40 В.

5. Рассмотреть гель с помощью трансиллюминатора в УФ-свете

После рестрикции эндонуклеазой Sdu1 полученных амплификатов на электрофореграмме наблюдается следующая картина: наличие двух полос размером 328 и 102 п.н. соответствует генотипу АА; четырех полос размером 328, 211, 117 и 102 п.н.- генотипу АВ, трех полос размером 211, 117 и 102 п.н. - генотипу ВВ (Рисунок 12).

Контрольные вопросы

1. Каковы основные условия проведения рестрикции?

2. Из каких этапов состоит цикл ПЦР?

3. Составьте реакционную смесь по гену альфа-лактальбумина

(bLALBA), которая готовится в объеме 20 мкл и содержит 2 мкл реакционного