Режим амплификации:

1 95°С – 5 мин;

1. 95°С – 45 с;

2. 55°С – 45 с;

3. 72°С – 45 с;

4. Стадии 2–4 повторяются 34 раза;

5. 72°С – 10 мин.

6. Если образцы не анализируются сразу после окончания амплификации, их следует поместить в холодильник на –20°С.

Рестрикционный анализ гена гипофизарного фактора транскрипции-1 ( bPit-1 )

Необходимые реактивы: амплификат, рестриктазы StuI и HinFI, 10х рестрикционный буфер, бидистиллированная вода, 6×DNA Loading Dye (краситель – 6×MassRuler™, раствор с красителями для нанесения образцов на гель), раствор бромистого 10 мг/мл этидия, маркер молекулярных масс TrackIt™ 50 bp DNA Ladder, агароза, 10×ТБЕ буфер

Необходимое оборудование и материалы: ПЦР-бокс, вортекс, камера для электрофореза, заливочный столик с гребенками, микроволновая печь или плитка, источник тока, трансиллюминатор для агарозно-этидиевых гелей, холодильник с морозильной камерой на –20°С, амплификатор, дозаторы с переменным объемом (0,1–10 мкл, 1–10 мкл, 10–100 мкл, 100–1 000 мкл), наконечники для дозаторов (0,1–10 мкл, 1–10 мкл, 10–100 мкл, 100–1 000 мкл), мерный стакан (100 мл – 1 шт., 1000 мл – 1 шт.), пробирки типа «Eppendorf» объемом 1,5 мл, микропробирки пластиковые с плоской крышкой типа «Eppendorf» объемом 0,2 или 0,5 мл соответственно амплификатору, штативы для микропробирок, лента лабораторная «Parafilm M», спирт для обработки столешницы и инструментов, емкости для отходов.

Ход работы:

1. Для идентификации аллелей гена гипофизарного фактора транскрипции1 продукты ПЦР разделяли на две аликвоты и обрабатывали эндонуклеазами рестрикции StuI и HinFI.

2. В реакционную смесь общим объемом 15 мкл вносят 1 мкл 10х буфера для рестриктазы StuI (HinFI), 0,5 мкл фермента StuI (HinFI), 5 мкл амплификата. Объем смеси доводят бидистилированной водой до 15 мкл.

3. Полученную смесь перемешать на вортексе и инкубировать в термостате в течение 16 часов при 37°С. Все операции проводить на лабораторном столе, фременты либо поместить в лед, либо кратковременно извлекать из морозильной камеры.

4. Приготовить 2%-ный агарозный гель для проведения электрофореза.

88

1. Нанести на гель рестрикцированные образцы, маркер молекулярных масс. Продукты рестрикции разделить в агарозном геле в течение 30 минут при напряжении 150 В.

2. Рассмотреть гель с помощью трансиллюминатора в УФ-свете.

Исследование полиморфизма нуклеотидной последовательности гена bPit - 1 в третьем экзоне, обусловленного трансверсией С→А, вызывающей замену аминокислоты пролин на гистидин в белковой последовательности, проводился с помощью рестриктазы StuI . Сайтом узнавания для рестриктазы StuI является последовательность AGG↓CCT. В ходе ферментации разрезается фрагмент, содержащий нуклеотид C, соответствующий аллелю bPit - 1 -StuI^С [151]. В случае присутствия А нуклеотида сайт рестрикции исчезает, а такой аллель обозначен как аллель bPit - 1 -StuI^А . Длина амплификата гена bPit - 1 в третьем экзоне составляет 234 п.н. Длина фрагментов после рестрикции составляет 197 и 37 п.н. На электрофореграмме видны варианты полос определенной длины, характерные для две полосы 197 и 37 п.н. (генотип bPit - 1 -StuI^СС ), три полосы 234, 197, 37 п.н. (генотип bPit - 1 -StuI^АС ). Фрагмент рестрикции 37 п.н. на агарозном геле не визуализируется (рисунок 15).

Дорожка 1 – ПЦР-продукт 234 п.н. фрагмента гена bPit - 1 -StuI;

Дорожка 2 – маркер молекулярных масс O’Range Ruler^TM 50 bp DNA Ladder, Fermentas, Литва;

Дорожки 3 – 9, 11, 12 – фрагмент рестрикции 197 п.н., соответствующий генотипу bPit - 1 -StuI^CC ; дорожка 10 – фрагменты рестрикции 234 и 197 п.н., соответствующие генотипу bPit - 1 -StuI^АC ;

Дорожка 13 – фрагмент рестрикции 234 п.н., соответствующие генотипу bPit - 1 -StuI^АА . Фрагмент рестрикции 37 п.н. не визуализируется. Положение на геле специфических полос показано стрелками.

Рисунок 15 — Электрофореграмма ДНК-типирования полиморфизма bPit - 1 -StuI.

Анализ полиморфизма нуклеотидной последовательности гена bPit - 1 в шестом экзоне проводился с помощью рестриктазы HinFI. Полиморфизм обусловлен A→G нуклеотидной заменой, не приводящей к изменению аминокислотной последовательности. Сайтом узнавания для рестриктазы HinFI является последовательность G↓ANTC. Разрезаемый в ходе ферментации фрагмент содержит нуклеотид А соответствующий аллелю bPit - 1 -HinFI^В . В случае присутствия G нуклеотида сайт рестрикции исчезает, такой аллель обозначен как bPit - 1 -HinFI^A .

Длина амплифицируемого фрагмента гена bPit - 1 составляет 451 п.н. Длина фрагментов после рестрикции составляет 244 и 207 п.н. На электрофореграмме визуализируются варианты полос определенной длины, характерные для генотипов: одна полоса 451 п.н. (генотип bPit - 1 -HinFI^АА ); две полосы 244 и 207 п.н. (генотип bPit - 1 -HinFI^ВB ); три полосы – 451, 244 и 207 п.н. (генотип bPit - 1 -HinFI^AВ ) (рисунок 16).

Дорожка 1 – маркер молекулярных масс O’Range Ruler^TM 50 bp DNA Ladder, Fermentas, Литва;

Дорожка 2 – ПЦР-продукт 451п.н. фрагмента гена bPit - 1 -HinFI;

Дорожка 3, 6 – фрагмент рестрикции 244, 207 п.н., соответствующий генотипу bPit - 1 -HinFI^BB ;

Дорожки 4,7 – фрагменты рестрикции 451, 244, 207 п.н., соответствующие генотипу bPit - 1 -HinfI^AB ;

Дорожка 5 – фрагмент рестрикции 451 п.н., соответствующий генотипу bPit - 1 -HinFI^AA . Положение на геле специфических полос показано стрелками.

Рисунок 16 - Электрофореграмма ДНК-типирования полиморфизма bPit - 1 -HinFI