На рисунке 14 приведена схема ПЦР анализа гена бета-лактоглобулина крупного рогатого скота с указанием длин образующихся фрагментов в зависимости от генотипа животных [53].

Контрольные вопросы

1. Составьте реакционную смесь по гену бета-лактоглобулина ( βLG ), которая готовится в объеме 20 мкл и содержит 2мкл 10х буфера, – 2 мкл MgCL2, – 2 мкл дНТФ (dNTP’s), 1 мкл каждого праймера, 0,4 мкл Taqполимеразы, 2 мкл геномной ДНК.

2. Проведите постановку ПЦР, используя программу: горячий старт – 5 мин при 94°С; 30 циклов: денатурация – 1 минута при 95°С; отжиг – 50 секунд при 59°С; синтез – 50 секунд при 72°С; достройка – 5 мин при 72°С.

3. Проведите визуализацию амплификата по гену бета-лактоглобулина ( βLG ) методом горизонтального электрофореза. Детекция результатов амплификации по гену бета-лактоглобулина: 8 мкл продукта амплификации + 0,5 мкл бромфенол голубого, раскапать в 1,5% агарозный гель (V=110, 30-35 мин.).

4. Проведите рестрикцию амплифицированного участка гена βLG . Для рестрикции амплифицированного участка гена βLG используют эндонуклеазы PvuII и PstI. Реакцию проводят при температуре 37 °С. Продукты рестрикции гена разделяют электрофоретически в 2 % агарозном геле в ТВЕ буфере с использованием бромистого этидия при напряжении 40 В в течение двух часов.

5. Какие фрагменты гена βLG образовались после рестрикции?

3.4 Проведение ПЦР-ПДРФ для генов соматотропинового каскада

Мясное скотоводство является перспективной отраслью животноводства и важным резервом увеличения производства высококачественного мяса говядины. Для успешного его развития необходимо проводить углублённую селекционную работу с учётом современных достижений генетики. При этом следует иметь в виду, что оценка животных по генетическим маркерам является более эффективной, если в неё включены гены одного физиологического пути, так как в таком случае экспрессия одного гена влияет на экспрессию всех остальных.

Большой интерес для повышения мясной продуктивности крупного рогатого скота представляют гены соматотропинового каскада, белковые продукты которых являются ключевыми звеньями одной гуморальной цепи, участвующей как в процессе лактации, так и в процессах роста и развития млекопитающих (bPit-1, bGH, bGHR, bIGF-1) Следовательно, изучение полиморфизмов этих генов является перспективным с точки зрения поиска маркеров, ассоциированных с признаками и молочной, и мясной продуктивности у крупного рогатого скота [101-103].

3.4.1 Постановка ПЦР-ПДРФ гена гипофизарного фактора транскрипции-1 ( bPit-1 )

Проведение амплификации гена гипофизарного фактора транскрипции-1 ( bPit-1 )

Необходимые реактивы: пробы ДНК, 10х ПЦР-буфер, деоионизированная вода, хлорид магния, Taq-полимераза, дезоксинуклеозидтрифосфаты (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), праймеры для исследуемого участков гена гипофизарного фактора транскрипции-1 ( bPit-1 ).

Необходимое оборудование и материалы: ПЦР-бокс, вортекс, холодильник с морозильной камерой на –20°С, амплификатор, дозаторы с переменным объемом (0,1–10 мкл, 1–10 мкл, 10–100 мкл, 100–1 000 мкл), наконечники для дозаторов (0,1–10 мкл, 1–10 мкл, 10–100 мкл, 100–1 000 мкл), пробирки типа «Eppendorf» объемом 1,5 мл, микропробирки пластиковые с плоской крышкой типа «Eppendorf» объемом 0,2 или 0,5 мл соответственно амплификатору, штативы для микропробирок, спирт для обработки столешницы и инструментов, емкости для отходов.

Ход работы:

1. Для установления генотипов крупного рогатого скота по локусу гипофизарного фактора транскрипции-1 используют следующие праймеры StuI-F: 5′-caaatggtccttttcttgttcag-3′;

StuI-R: 5′-ctttaaactcatggcaaatttc-3′ [165];

HinFI-F: 5′-aaaccatcatctcccttctt-3′;

HinFI-R: 5′-aatgtacaatgtcttctgag-3′ [120].

1. Приготовить реакционную смесь для проведения ПЦР. Смесь без ДНК матрицы приготовить в одной пробирке и затем аликвотировать по индивидуальным.

На 1 реакцию понадобится 20 мкл реакционной смеси. Необходимо взять:

– 0.3 мкл смеси dNTP;

• 2 мкл 10х ПЦР-буфера;

• 1,5 мкл прямого и 1,5 мкл обратного праймеров;

• 2 мкл хлорида магния;

• 0,4 мкл Taq-полимеразы;

• 11,2 мкл деионизованной воды.

Перемешать все компоненты. Taq-полимеразу добавить в последнюю

очередь, вынув ее из морозильной камеры холодильника и поместив на лед.

1. Полученную реакционную смесь раскапать в подготовленные пробирки. 4. Добавить в каждую пробирку, кроме пробирки с отрицательным контролем, по 1,5 мкл матричной ДНК.

2. Поместить пробирки в амплификатор и запустить соответствующий режим, который должен соответствовать праймерам, используемым в реакции.