количество внесенного образца.

Контрольные вопросы:

1. В чем принцип метода спектрофотометрического определения концентрации нуклеиновых кислот?

2. При какой длине волны оценивают концентрацию ДНК спектрофотометрическим методом: а) 260нм и 280нм; б) 280нм и 300нм; в) 180нм и 280нм; г) 200нм и 350нм.

3. Какая масса агарозы необходима для приготовления 150 мл 2.5%-ного геля?

4. Приготовить 1 % агарозный гель для проведения гель-электрофореза. Растворить 1 г агарозы в 99 мл 1хТВЕ (1 % гель). Нагреть до 100 °С для растворения агарозы, постоянно перемешивая раствор, и медленно охладить до 40–50 °С. Добавить в раствор агарозы бромистый этидий. Затем с помощью специальной кюветы и гребенки сформировать гель с лунками.

5. Определить качество выделенной ДНК методом электрофореза.

3.3 Проведение ПЦР-ПДРФ для генов молочных белков

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим рестрикционным анализом является стандартным анализом точковых мутаций для диагностики аллельного полиморфизма генов-кандидатов, связанных с продуктивными качествами сельскохозяйственных животных. По длине фрагментов (ПДРФ) делают вывод об отсутствии или наличии точковой мутации, а также о гомозиготности или гетерозиготности особи [309].

Метод ПЦР-ПДРФ дал возможность идентифицировать генотипы белков молока на ранних стадиях развития животного, что значительно ускоряет решение некоторых актуальных задач современной селекции. Использование ПЦР облегчает процедуру анализа и открывает возможность массовых исследований ДНК сельскохозяйственных животных и проведения

75

практической селекции на уровне генотипов. Преимущество генной диагностики объясняется тем, что она базируется непосредственно на анализе наследственной информации, лежащей в основе того или иного признака [310]. Широкое применение метода ПЦР ускорило и упростило диагностику точковых мутаций, которые являются причиной полиморфизма большинства генов белков молока. Высокая чувствительность метода позволяет определить аллели, различающиеся заменой лишь одного полиморфизма большинства генов белков молока [310].

3.3.1 Постановка ПЦР-ПДРФ для гена каппа-казеина ( bCSN3 )

Проведение амплификации гена каппа-казеина bCSN3

Необходимые реактивы: пробы ДНК, буферный раствор, деоионизированная вода, хлорид магния, Taq-полимераза, дезоксинуклеозидтрифосфаты (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), праймеры для исследуемого участков гена bCSN3 .

Необходимое оборудование и материалы: ПЦР-бокс, вортекс, холодильник с морозильной камерой на –20°С, амплификатор, дозаторы с переменным объемом (0,1–10 мкл, 1–10 мкл, 10–100 мкл, 100–1 000 мкл), наконечники для дозаторов (0,1–10 мкл, 1–10 мкл, 10–100 мкл, 100–1 000 мкл), пробирки типа «Eppendorf» объемом 1,5 мл, микропробирки пластиковые с плоской крышкой типа «Eppendorf» объемом 0,2 или 0,5 мл соответственно амплификатору, штативы для микропробирок, спирт для обработки столешницы и инструментов, емкости для отходов.

Ход работы:

1. Для установления генотипов крупного рогатого скота по локусу каппаказеина используют следующие праймеры [311]: VAR5: 5′-atagccaaatatatcccaattcag t-3′;

VAR3: 5′-tttattaataagtccatgaatctt g-3′.

1. Приготовить реакционную смесь для проведения ПЦР. Смесь без ДНК матрицы приготовить в одной пробирке и затем аликвотировать по индивидуальным.

На 1 реакцию понадобится 18,5 мкл реакционной смеси. Необходимо взять:

– 0,5 мкл смеси dNTP;

– 2 мкл реакционного буфера;

– 1,5 мкл прямого и 1,5 мкл обратного праймеров;

• 1,8 мкл хлорида магния;

• 0,3 мкл Taq-полимеразы;

• 10,9 мкл деионизованной воды.

Перемешать все компоненты. Taq-полимеразу добавить в последнюю очередь, вынув ее из морозильной камеры холодильника и поместив на лед.

1. Полученную реакционную смесь раскапать в подготовленные пробирки.

2. Добавить в каждую пробирку, кроме пробирки с отрицательным контролем, по 1,5 мкл матричной ДНК.

3. Поместить пробирки в амплификатор и запустить соответствующий режим, который должен соответствовать праймерам, используемым в реакции. Режим амплификации:

1 95°С – 5 мин;

1. 94°С – 60 с;

2. 58°С – 60 с;

3. 72°С – 60 с;

4. Стадии 2–4 повторяются 35 раз;

5. 72°С – 5 мин.

6. Если образцы не анализируются сразу после окончания амплификации, их следует поместить в холодильник на –20°С.

Рестрикционный анализ гена каппа-казеина bCSN3

Необходимые реактивы: амплификат, рестриктаза HindIII, рестрикционный буфер «W» с добавлением BSA (СибЭнзим, Россия), бидистиллированная вода, 6×DNA Loading Dye (краситель – 6×MassRuler™, раствор с красителями для нанесения образцов на гель), раствор бромистого этидия, маркер молекулярных масс 50 п.н., агароза, 10×ТБЕ буфер.

Необходимое оборудование и материалы: ПЦР-бокс, вортекс, камера для электрофореза, заливочный столик с гребенками, микроволновая печь или плитка, источник тока, трансиллюминатор для агарозно-этидиевых гелей, холодильник с морозильной камерой на –20°С, амплификатор, дозаторы с переменным объемом (0,1–10 мкл, 1–10 мкл, 10–100 мкл, 100–1000 мкл), наконечники для дозаторов (0,1–10 мкл, 1–10 мкл, 10–100 мкл, 100–1 000 мкл), мерный стакан (100 мл – 1 шт., 1000 мл – 1 шт.), пробирки типа «Eppendorf» объемом 1,5 мл, микропробирки пластиковые с плоской крышкой типа «Eppendorf» объемом 0,2 или 0,5 мл соответственно амплификатору, штативы для микропробирок, лента лабораторная «Parafilm M», спирт для обработки столешницы и инструментов, емкости для отходов.

Ход работы:

1. Обработать 10 мкл полученного амплификата 20 ед. эндонуклеазой рестрикции HindIII в 1хбуфере «W» с добавлением BSA (СибЭнзим, Россия).

2. Полученную смесь перемешать на вортексе и инкубировать в термостате в течение 8 часов при 37°С. Все операции проводить на лабораторном столе,