фременты либо поместить в лед, либо кратковременно извлекать из морозильной камеры.

1. Приготовить 2%-ный агарозный гель для проведения электрофореза.

2. Нанести на гель рестрикцированные образцы, маркер молекулярных масс. Продукты рестрикции разделить в готовом агарозном геле в течение 2-х часов при напряжении 40 В.

3. Рассмотреть гель с помощью трансиллюминатора в УФ-свете.

Рестриктаза PvuII позволяет выявить варианты А, В и D гена беталактоглобулина, а рестриктаза PstI – вариант С. Наличие двух специфических фрагментов рестрикции по PvuII длиной 774 и 474 п.н. соответствует аллелю А. Точковая мутация в нуклеотидной последовательности варианта В обуславливает образование дополнительного сайта рестрикции PvuII и приводит к образованию трех специфических для аллеля В фрагментов длиной 774, 297 и 177 п.н. Результатом нуклеотидной замены в аллеле D гена беталактоглобулина является образование еще одного специфического для PvuII сайта, и как следствие, - появление четырех рестрикционных фрагментов длиной 563, 297, 211 и 177 п.н.

Рестрикция с использованием эндонуклеазы PstI позволяет диагностировать аллель С гена бета-лактоглобулина. В нуклеотидной последовательности варианта С имеется лишь один общий для всех аллелей сайт узнавания PstI, в то время как в вариантах А, В и D присутствует дополнительный рестрикционный сайт для эндонуклеазы PstI. При гидролизе по PstI последовательности варианта С в геле визуализируются два фрагмента длиной 182 п.н. и 1066 п.н., в то время как при гидролизе аллелей А, В и D помимо общего фрагмента длиной 179 п.н. образуются два специфических фрагмента длиной 896 и 170 п.н. (рисунок 13)

На рисунке 14 приведена схема ПЦР анализа гена бета-лактоглобулина крупного рогатого скота с указанием длин образующихся фрагментов в зависимости от генотипа животных [53].

Контрольные вопросы

1. Составьте реакционную смесь по гену бета-лактоглобулина ( βLG ), которая готовится в объеме 20 мкл и содержит 2мкл 10х буфера, – 2 мкл MgCL2, – 2 мкл дНТФ (dNTP’s), 1 мкл каждого праймера, 0,4 мкл Taqполимеразы, 2 мкл геномной ДНК.

2. Проведите постановку ПЦР, используя программу: горячий старт – 5 мин при 94°С; 30 циклов: денатурация – 1 минута при 95°С; отжиг – 50 секунд при 59°С; синтез – 50 секунд при 72°С; достройка – 5 мин при 72°С.

3. Проведите визуализацию амплификата по гену бета-лактоглобулина ( βLG ) методом горизонтального электрофореза. Детекция результатов амплификации по гену бета-лактоглобулина: 8 мкл продукта амплификации + 0,5 мкл бромфенол голубого, раскапать в 1,5% агарозный гель (V=110, 30-35 мин.).

4. Проведите рестрикцию амплифицированного участка гена βLG . Для рестрикции амплифицированного участка гена βLG используют эндонуклеазы PvuII и PstI. Реакцию проводят при температуре 37 °С. Продукты рестрикции гена разделяют электрофоретически в 2 % агарозном геле в ТВЕ буфере с использованием бромистого этидия при напряжении 40 В в течение двух часов.

5. Какие фрагменты гена βLG образовались после рестрикции?

3.4 Проведение ПЦР-ПДРФ для генов соматотропинового каскада

Мясное скотоводство является перспективной отраслью животноводства и важным резервом увеличения производства высококачественного мяса говядины. Для успешного его развития необходимо проводить углублённую селекционную работу с учётом современных достижений генетики. При этом следует иметь в виду, что оценка животных по генетическим маркерам является более эффективной, если в неё включены гены одного физиологического пути, так как в таком случае экспрессия одного гена влияет на экспрессию всех остальных.

Большой интерес для повышения мясной продуктивности крупного рогатого скота представляют гены соматотропинового каскада, белковые продукты которых являются ключевыми звеньями одной гуморальной цепи, участвующей как в процессе лактации, так и в процессах роста и развития млекопитающих (bPit-1, bGH, bGHR, bIGF-1) Следовательно, изучение полиморфизмов этих генов является перспективным с точки зрения поиска маркеров, ассоциированных с признаками и молочной, и мясной продуктивности у крупного рогатого скота [101-103].