ферменты либо поместить в лед, либо кратковременно извлекать из морозильной камеры.

1. Приготовить 2%-ный агарозный гель для проведения электрофореза.

2. Нанести на гель рестрикцированные образцы, маркер молекулярных масс. Продукты рестрикции разделить в готовом агарозном геле в течение 30 минут при напряжении 150 В.

3. Рассмотреть гель с помощью трансиллюминатора в УФ-свете.

Полиморфизм нуклеотидной последовательности гена инсулиноподобного фактора роста-1 bIGF - 1 в области Р1 промоторного региона идентифицирован как Т→С трансверсия. Эта замена распознается рестриктазой SnaBI . Амплифицируется фрагмент гена bIGF - 1 длиной 249 п.н. [304]. Длина фрагментов после рестрикции составляет 223 и 26 п.н. На электрофореграмме могут быть видны варианты полос определенной длины, характерные для генотипов: одна полоса 249 п.н. (генотип bIGF - 1 -SnaBI^ВВ ); две полосы 223 и 26 п.н. (генотип bIGF - 1 -SnaBI^АA ); три полосы 249, 223 и 26 п.н. (генотип bIGF - 1 - SnaBI^АB ). Фрагмент 26 п.н. на агарозном геле не визуализируется (рисунок 19).

Дорожка 1 – маркер молекулярных масс O’Range Ruler^TM 50 bp DNA Ladder, Fermentas, Литва;

Дорожка 2 – ПЦР-продукт 249 п.н. фрагмента гена bIGF - 1 -SnaBI; Дорожки 3, 4 – фрагменты рестрикции 249 и 223 п.н., соответствующие генотипу -SnaBI^АВ ;

Дорожки 5, 6 – фрагмент рестрикции 223 п.н., соответствующий генотипу bIGF - 1 -SnaBI^АА ;

Дорожка 7 – фрагмент рестрикции 249 п.н., соответствующий генотипу bIGF - 1 -SnaBI^ВВ . Фрагмент 26 п.н. не визуализируется. Положение на геле специфических полос показано стрелками.

Рисунок 19 – Электрофореграмма ДНК-типирования полиморфизма bIGF - 1 -SnaBI

Контрольные вопросы:

1. Из каких компонентов состоит реакционная смесь для амплификации ДНК?

2. Составьте реакционную смесь по гену инсулиноподобного фактора роста-1 ( bIGF-1 ), которая готовится в объеме 20 мкл и содержит 2 мкл 10х буфера, 2 мкл MgCL2, 0,25 мкл дНТФ (dNTP’s), 1,7 мкл каждого праймера, 0,3 мкл Taq-полимеразы, 1,5 мкл геномной ДНК.

3. Проведите постановку ПЦР, используя программу: горячий старт – 5 минут при 95°С; 35 циклов: денатурация – 30 секунд при 95°С; отжиг – 30 секунд при 64°С; синтез – 30 секунд при 72°С; достройка – 10 минут при 72°С.

4. Проведите визуализацию амплификата по гену инсулиноподобного фактора роста-1 методом горизонтального электрофореза. Детекция результатов амплификации по гену гормона роста: 5 мкл продукта амплификации + 0,5 мкл бромфенол голубого, раскапать в 1,5% агарозный гель (V=110, 30-35 мин.).

5. Проведите рестрикцию амплифицированного участка гена инсулиноподобного фактора роста-1. Для рестрикции амплифицированного участка гена bIGF-1 используют эндонуклеазу SnaBI. Реакцию проводят при температуре 37°С. Продукты рестрикции генов разделяют электрофоретически в 2% агарозном геле (при напряжении 150 В) 30 мин в ТВЕ буфере при УФсвете с использованием бромистого этидия на системе гель-документирования.

3.5 Ошибки ПЦР-ПДРФ и их предотвращение

Достоверность заключений по любому эксперименту определяется качеством полученных результатов. Ошибки проведения ПЦР-ПДРФ могут быть обусловлены различными причинами. Минимизирование ошибок возможно при оценке особенностей используемых экспериментальных методов, их оптимизации, надлежащему использованию контролей, повторностей, а также разработки статистических подходов для выявления ошибок [313].

Ошибки разделены исследователями на категории [314].

1 - обусловленные особенностями собственно последовательности молекулы ДНК.

2 - низкое качество и/или недостаточное количество ДНК. Как низкое качество, так и малое количество ДНК обуславливают «выпадение» (dropout) аллелей в гетерозиготах (амплификация только одной предпочтительно более короткой аллели). При контаминации образцов ДНК возможна амплификация контаминантных аллелей. Одним из решений проблемы в случае малого количества ДНК предложен метод разделения образца на несколько пробирок и проведение реакции амплификации в каждой из них [315].

3 - артефакты, обусловленные реагентами. Ошибки, связанные с особенностью Tag-полимеразы добавлять к 3´-концу не принадлежащий к последовательности амплифицируемого фрагмента нуклеотид (как правило, аденин). Эта реакция чувствительна к последовательности 5´-конца праймера и длительному времени элонгации в ПЦР. «Slippage» («запинание») Tagполимеразы на первых стадиях ПЦР приводит к появлению ложных аллелей. Реагенты низкого качества могут отрицательно влиять на условия ПЦР, неадекватные условия электрофореза могут приводить к искаженной картине распределения аллелей по размеру и т.д.

4 - человеческий фактор. Существенная доля ошибок ПЦР-ПДРФ обусловлена именно этим фактором [316. Так, это может быть связано с субъективностью оценки электрофореграмм и радиоавтограмм, и соответствующим некорректным обозначением аллелей, что в свою очередь зависит и от качества данных; загрязнение экзогенной ДНК или случайное перекрестное «заражение» образцов, использование неоптимальных протоколов, неоптимальных праймеров, температуры плавления в ПЦР, ошибки при вводе и обработке данных и др. [317]. На практике для выявления ошибок ПЦР-ПДРФ проводится повторная реакция амплификации и сравнение полученных продуктов первоначального и повторного анализа для определенного ряда образцов, другими словами – анализ дублированных образцов [318]

В свою очередь ошибки ПЦР-ПДРФ, возникающие при действии человеческого фактора, также условно можно разделить на три категории, соответствующие этапам анализа:

• Ошибки преаналитического этапа. Данный этап включает взятие биоматериала, его хранение и транспортировку, пробоподготовку. В первую очередь, необходимо правильно определить место взятия биологического материала для исследования. Второй распространенной ошибкой преаналитического этапа является неправильное взятие материала на исследование. При работе с кровью важно учитывать тот факт, что для предотвращения ее свертывания в процессе доставки необходимо использовать антикоагулянты. Однако, наиболее распространенный антикоагулянт – гепарин является мощным ингибитором ПЦР, поэтому его использование в данном случае недопустимо. Принципиальным для получения адекватных результатов ПЦР является хранение биологического материала. Необходимо помнить о температуре хранения биологического материала, а также сроках и способах его доставки в ПЦР-лабораторию в случае, если транспортировка требует значительного времени. При нарушении сроков хранения или транспортировки биоматериала ДНК или РНК могут разрушаться, что приведет к ложноотрицательным результатам. Образцы рекомендуется хранить при температуре от 2 до 8°С в течение 24-48 часов, для более длительного хранения необходимо замораживание.