- Ошибки аналитического этапа. Проведение собственно лабораторного исследования также может сопровождаться рядом ошибок, среди которых одной из основных является неправильный выбор системы пробоподготовки. Выбор метода выделения должен определяться характером биоматериала, степенью его загрязнения потенциальными ингибиторами ПЦР. Использование экспресс-методов существенно сокращает время пробоподготовки, делает минимальными потери ДНК в процессе выделения и существенно сокращает риск кросс-контаминации, что представляется весьма привлекательным для рутинного использования в лаборатории. Однако, существенным недостатком данной группы методов является низкая степень очистки пробы от ингибиторов, следствием чего 3-5% образцов дают недостоверные результаты в ПЦР. Сорбентные методы можно определить, как «универсальные», однако для них характерно длительное время выделения, что может привести к перекрестной контаминации; потери ДНК с сорбентом – выход ДНК напрямую зависит от качества сорбента.

• Ошибки постаналитического этапа. Основной проблемой постаналитического этапа является неверная интерпретация исследователем результатов ПЦР-ПДРФ анализа [319].

ПЦР-ПДРФ анализ связан с проблемой, обусловленной высокой чувствительностью метода, – возможностью контаминации.

Контаминация – попадание из внешней среды в реакционную смесь специфических и неспецифических молекул нуклеиновых кислот, способных служить мишенями в реакции амплификации и давать ложноположительные или ложноотрицательные результаты.

Сотрудник, занимающийся ПЦР-ПДРФ диагностикой, в своей работе сталкивается с тремя видами контаминации:

1. Перекрестная контаминация от пробы к пробе (в процессе обработки биоматериала или при раскапывании реакционной смеси), приводящая к появлению ложноположительных результатов.

2. Контаминация продуктами амплификации (ампликонами), имеющая наибольшее значение, поскольку в процессе ПЦР ампликоны накапливаются в огромных количествах и являются идеальными продуктами для реамплификации.

3. Контаминация следовыми количествами ампликонов посуды, автоматических пипеток и лабораторного оборудования, поверхностей лабораторных столов или даже поверхности кожи сотрудников лаборатории приводит к появлению систематических ложноположительных результатов.

Как правило, определить источник контаминации бывает очень трудно и требует значительных затрат времени и средств [320].

Основными правилами предотвращения контаминации в лаборатории являются:

• Разделение функциональных рабочих зон;

• Соблюдение поточности и направления движения анализируемых образцов;

• Отдельные лабораторные халаты в каждой рабочей зоне;

• Одноразовые перчатки без талька;

• Наконечники для дозаторов с фильтрами, защищающими от аэрозоля;

• Одноразовые пластиковые пробирки, посуда, наконечники;

• Химическая и УФ дезинфекция всех поверхностей рабочих зон.

Все три зоны должны быть изолированными комнатами, снабженными предбоксниками. Полезно иметь устройство фильтрации воздуха.

Кроме того, желательно предусмотреть отдельные помещения для переодевания и хранения верхней одежды, приема пищи, складское помещение для лабораторных материалов. Все производственные комнаты должны быть снабжены коротковолновыми ультрафиолетовыми лампами. Перемещение пробирок, штативов и пр. должно производиться только в направлении из «чистой» зоны в зоны пробоподготовки и детекции. Клинический материал, поступивший в лабораторию, должен быть как можно быстрее обработан в комнате пробоподготовки. В эту же комнату должны поступать пробирки с реакционной смесью из «чистой» зоны для внесения в них препаратов ДНК. После этого пробирки помещают в амплификатор и, по окончании термоциклирования, не открывая крышек, переносят в зону детекции. Все операции (пробоподготовка, подготовка реакционной смеси, электрофорез) должны выполнять разные люди [321].

Контрольные вопросы

1. На какие категории можно разделить ошибки проведения ПЦР-ПДРФ?

2. Появление ложноположительных результатов при попадании в пробирку следовых количеств положительной ДНК – это: а) кроссинговер; б) конъюгация; в) контаминация; г) корреляция

3. Основные принципы предотвращения контаминации при работе с биологическим материалом.

4. Условия хранения биологического материла.

5. Какие меры необходимо предпринять, если были выявлены ошибки

ПЦР-ПДРФ анализа?

3.6 Статистическая обработка данных для оценки эффективности маркеров

Объем производства продукции животноводства непосредственно определяется двумя показателями - численностью животных и их продуктивностью. При учете численности животных их дифференцируют по видам, породам, возрасту, полу, производственному назначению,

продуктивности и т.д. Все виды животных в первую очередь подразделяют на основное стадо (матки и самцы - производители) и молодняк.

При анализе валовой продукции животноводства рассматривают продукцию нормальной жизнедеятельности животных, связанной с хозяйственным использованием животных как средство производства (молоко), а также продукцию выращивания скота (мясная продукция), использование которой для потребления человеком предполагает забой животных. Продуктивность представляют собой выход продукции на 1 голову животных. При оценке молочной продуктивности существенное значение имеет учет качества молока (калорийность, содержание сухих веществ, жира, белка, молочного сахара). Источниками статистических данных о численности и продуктивности скота являются годовые, месячные и квартальные отчеты; отчеты о состоянии животноводства.

Статистическую обработку результатов ПЦР-ПДРФ и данных зоотехнического и племенного учета проводят методами популяционногенетического и биометрического анализа (П.Ф. Рокицкий, 1961; Н.А. Плохинский, 1970; Е.К. Меркурьева, 1977) [322].

Исследование генетической структуры крупного рогатого скота включает сравнение выборок по распределению частот аллельных вариантов генов соматотропинового каскада, а также оценку соответствия распределения частот генотипов теоретически ожидаемому в соответствии с законом ХардиВайнберга.

Частоты генотипов определяются методом прямого подсчета Относительную частоту аллелей рассчитывают по формуле (2):

p=(2nAA+nAB)/2N и q=(2nBB+nAB)/2N (2)

где p – частота аллеля A , q – частота аллеля B , nAA , nAB , nBB – число особей с данным генотипом, N – общее число особей [323].

Статистическую ошибку относительных частот аллелей вычисляют по формуле (2):

SQ=√(Q(1- Q)/2n) (2)

где Q − относительная частота исследуемого аллеля; n − объем выборки [324].

Cравнение выборок по распределению частот аллельных вариантов исследуемых генов проводят с помощью критерия χ² , формула (3). Число степеней свободы =1:

χ 2 =∑(Но-Не)/Не (3)

где Но − наблюдаемые частоты аллелей;

106