3 Исследование полиморфных генов молочной и мясной продуктивности крупного рогатого скота методом ПЦР-ПДРФ
Стандартным методом выявления полиморфизма структурных генов на уровне ДНК является ПЦР-анализ с последующим рестрикционным гидролизом образующихся фрагментов (ПЦР-ПДРФ). Суть метода заключается в амплификации определенного фрагмента ДНК, содержащего анализируемую точковую мутацию, с последующим расщеплением наработанного ампликона соответствующей рестриктазой для идентификации аллелей анализируемого гена. Он рутинно используется для диагностики аллельного полиморфизма ряда генов-кандидатов, связанных с локусами хозяйственно-полезных признаков сельскохозяйственных животных [298].
Благодаря таким свойствам, как простота и надежность, данный метод получил широкое распространение и до сих пор популярен, хотя и имеет некоторые ограничения – во-первых, он позволяет детектировать только полиморфизмы единичных нуклеотидов, расположенные в сайтах рестрикции, а во-вторых, годится лишь для детекции уже известных полиморфизмов единичных нуклеотидов [299].
Анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ) состоит из нескольких стадий. Прежде всего, проводят выделение геномной ДНК. Далее ДНК-фрагмент, содержащий исследуемую последовательность, амплифицируют с помощью полимеразной цепной реакции. Затем амплифицированный фрагмент гидролизуют подходящей рестриктазой. Рестрикт разделяют гель-электрофорезом и после проводят идентификацию фрагментов ДНК.
Способ ПДРФ-анализа обширно используют при молекулярногенетических изучениях популяций, так как присутствие в геноме индивида рестрикционных фрагментов ДНК известного размера, представляет собой отличный генетический маркер и в то же время фенотипический признак, очень близко связанный с генотипом особи. Что дает возможность контролировать распространение данного маркера в популяции, передавая его из поколения в поколение и используются для составления генетических карт изученных особей классическими генетическими методами. ПДРФ – маркеры из-за их строгой привязки к известным локусам гена не проигрывают по информационному содержанию общим биохимическим маркерам и часто становятся более подходящие, чем сложные фенотипические признаки (например, окрас радужки глаза, окрас шерстного или волосяного покрова, внешний вид листа или цветка у растений), которые определяются большим количеством локусов генов [База знаний по биологии человека. ПДРФ-анализ (RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism) метод [300].
Контрольные вопросы
-
Проведите хронологию происходящих процессов: а) приготовление рестрикционной смеси для ПЦР; б) выделение ДНК; в) постановка ПДРФанализа; г) постановка ПЦР; д) визуализация полученного продукта и статистическая обработка результатов
-
Каков механизм действия ферментов рестрикции ДНК?
-
Из скольких стадий состоит ПДРФ-анализ?
-
Последовательность в молекуле ДНК, в месте расположения которой рестрикционная нуклеаза разрезает: а) сайт узнавания; б) сайт прикрепления; в) сайт рестрикции; г) специфический сайт
5. Соотнесите термины и понятия:
| 1. Праймер | а) спонтанное или индуцированное изменение структуры гена; |
|---|---|
| 2. Мутация | б) нуклеозид, к которому присоединена одна или более фосфатных групп; |
| 3. Нуклеотид | в) короткий олигонуклеотид, который гибридизуется с матрицей и служит затравкой при ее копировании; |
| 4. Локус | г) место на хромосоме, где находиться специфический ген. |
3.1 Пробоподготовка и выделение ДНК из образца
Взятие биологического материала. При отборе материала необходимо соблюдать меры, предупреждающие заражение людей, контаминирование объектов внешней среды, возможность переноса возбудителя от одной пробы к другой. Трудность исключения контаминации заключается в том, что инактивированные микроорганизмы остаются источниками нуклеиновых кислот, поэтому обработка, например, рук, инструментов спиртом не предотвратит контаминации проб посторонней ДНК.
Один из основных принципов предотвращения контаминации - аккуратность. Необходимо следить за тем, чтобы инструменты, руки и прочие поверхности, соприкасающиеся с биоматериалом, пробой, не контактировали с другой пробой либо чистыми посудой, инструментами, руками.
Другой принцип - использование одноразовой, пластиковой посуды, контейнеров и перчаток.
Третий принцип - разрушение нуклеиновых кислот на поверхностях инструментов, мебели. Инструменты, перед отбором очередной пробы необходимо очищать и обжигать над пламенем спиртовки. Помещение пред началом работы желательно обрабатывать ультрафиолетовым излучением в течение часа. После работы помещение, мебель и инструменты желательно очистить от остатков биоматериала. Инструменты, стеклянную посуду, кюветы можно залить 5% раствором хлорамина, после чего удалить хлорамин стерильной дистиллированной водой. Для мытья кювет можно использовать автоклавированную тряпку.
Четвертый принцип - сохранение нуклеиновых кислот в пробе от разрушающего действия нуклеаз (ферментов, разрушающих нуклеиновые кислоты). На стадии отбора биоматериала, его хранения и транспортировки, данный принцип реализуется путем создания неблагоприятных для работы нуклеаз условий - замораживание, либо высушивание проб [301].
1. Отбор цельной крови. У крупного рогатого скота кровь отбирают из ярёмной или хвостовой вены в объёме не менее 5 мл одноразовой иглой (диаметр 0,8 - 1,1 мм) в специальную вакуумную систему типа "Vacuett" (сиреневые крышки - 6% ЭДТА) или одноразовым шприцем в пластиковые пробирки с цитратом натрия (3,8% раствор цитрата натрия в соотношении 1:9). Перед взятием крови иглы необходимо простерилизовать кипячением. Кровь от каждого животного берут индивидуальной иглой. Место взятия крови тщательно дезинфицируют спиртом или 5% раствором йода. После взятия крови пробирку следует плавно несколько раз перевернуть вверх дном, чтобы кровь в пробирке тщательно перемешалась с антикоагулянтом (в противном случае кровь свернется и выделение ДНК/РНК станет невозможным). После плавного перемешивания пробирку поместить в штатив. Гепарин в качестве антикоагулянта использовать нельзя, так как он является мощным ингибитором ПЦР.
Следует строго соблюдать температурные режимы хранения и транспортирования отобранного материала. Транспортирование осуществляют в термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом. При хранении материала более суток его необходимо заморозить при температуре минус 20°С.
2. Отбор волосяных луковиц. Для отбора волосяных луковиц поверхность кожи животного в зоне ушной раковины и волосы обрабатывают спиртом, после чего проводят аккуратное выдергивание волос. Необходимо следить, чтобы на концах взятых волос оставались волосяные луковицы, потому что именно они используются для анализа. От одного животного необходимо выдернуть 30-40 волос с луковицами. Вырванные волосы упаковывают в плотный бумажный пакет, после чего транспортируют или хранят в сухом, темном месте.
Все образцы должны иметь необходимую информацию: порода, пол, кличка, год и место рождения, идентификационный номер, а также данные о продуктивности животных в зависимости от цели исследования.
Выделение ДНК из исследуемого объекта. Самым первым и важным этапом ПЦР-ПДРФ является выделение ДНК из различного материала, которое предопределяет качество пробоподготовки и успех дальнейших исследований. От качества его исполнения зависит успех всех последующих этапов исследования. Неправильный выбор метода выделения ДНК или его неверное осуществление могут привести либо к получению загрязненной ДНК, непригодной для исследования, либо вообще к потере ДНК [302].
