Выбор метода выделения ядерной ДНК определяется в зависимости от исходного материала, а также цели исследования и необходимого времени хранения выделенной ДНК. Имеется множество методов выделения нуклеиновых кислот, такие как детергентный, фенольный, фенольнодетергентный, а также сорбционные способы экстракции, которые получили широкое распространение благодаря эффективному получения препаратов ДНК приемлемой чистоты и концентрации из биоматериала [303].

Этапы выделения ДНК включают быстрый лизис клеток, удаление фрагментов клеточных органелл и мембран с помощью центрифугирования, ферментативное разрушение белков протеиназами и экстрагирование ДНК из раствора с помощью фенола и хлороформа. Затем ДНК осаждают, как правило, этанолом и после удаления надосадочной жидкости растворяют в буферном растворе [304].

Колоночное выделение ДНК. Метод колоночного выделения использует способность ДНК и РНК адгезироваться к поверхности диоксида кремния в присутствии хаотропных ионов, и легко смываться в их отсутствии. Данный метод пришел из органической химии, где на первых этапах набивались стеклянные колонки различными материалами, в том числе диоксидом кремния, потом ДНК и РНК смывались, и далее колонка разбиралась и набивалась заново. Чтобы исключить эти трудоемкие этапы, было предложено использовать одноразовые пластиковые колонки, уже с прослойкой диоксидом кремния, которые идеально подходят по размеру к обычным пробиркам Eppendorf на 1,5 и 2 мл.

Колоночный метод выделения ДНК обладает рядом преимуществ:

• Быстрота выделения (20-40 минут в зависимости от количества образцов биоматериала);

• Эффективное связывание ДНК с мембраной колонки позволяет получить наибольший выход ДНК из образца;

• Высокая степень очистки достигается благодаря оптимизированному

• составу компонентов лизирующего и промывочных растворов;

• Чистота выделенной ДНК составляет 1,8-1,9 по соотношению A260/A280;

• Выделение ДНК на колонках существенно уменьшает расход дополнительного пластика;

• Отсутствие токсичных реагентов (фенол, хлороформ и т.д.)

Одним из недостатков колоночного метода выделения ДНК является сложность получения неповрежденных длинных молекул ДНК, он рекомендуется для выделения молекул не более 50 тысяч п.н. Для анализа более крупных молекул подойдут наборы для выделения ДНК в растворе - более специализированные и сложные в использовании комплекты реагентов.

Для выделения ДНК колоночным методом можно использовать коммерческий набор PureLink Genomic DNA Mini Kit (рисунок 6). Набор позволяет выделять геномную ДНК из крови, тканей, клеток, слюны, бактерий, мазков и пятен крови, формалин-фиксированных парафиновых тканей.

Выделение ДНК с использованием коммерческого набора «Pure Link Genomic DNA Kits»

Состав набора:

• колонки PureLink® Spin Column;

• сборные трубки;

• пробирки 1.5 мл;

• протеиназа К;

• РНКаза A;

• лизирующий раствор;

• промывочный буфер 1;

• промывочный буфер 2;

• элюирующий раствор.

Необходимое оборудование и материалы: ПЦР-бокс, водяная баня либо твердотельный термостат для микропробирок, микроцентрифуга для микропробирок (скорость вращения не менее 10000 об/мин), вортекс (прибор для встряхивания и перемешивания, дозаторы с переменным объемом: 10-100 мкл и 200-1000 мкл), пробирки типа «Eppendorf» 1.5 мл, штативы для микропробирок, емкости для отходов.

Ход работы:

1. Установить водяную баню или термостат при температуре 55 ° С.

2. Добавить 200 мкл крови в микропробирки Pure Link с фильтром, при этом на дозаторы лучше надевать наконечники с фильтром, так как кровь может содержать посторонние примеси.

3. Добавить 20 мкл протеиназы K в образец для лизирования клетки.

4. Добавить 20 мкл РНКазы А, смешать, инкубировать 2 минуты при комнатной температуре.

1. Добавить 200 мкл лизирующего раствора и хорошо перемешать на

вортексе, чтобы получить гомогенный раствор.

1. Инкубировать при 55 ° C в течение 10 минут.

2. Добавить 200 мкл 96-100% этанола в лизат и хорошо перемешать.

3. Извлечь колонку PureLink® Spin Column в сборную трубку из упаковки.

4. Добавить лизат (~ 640 мкл) в колонку PureLink®.

5. Центрифугировать колонку при 10000 об/мин в течение 1 минуты при комнатной температуре.

6. Удалить сборную трубку и поместить спин-колонку в чистую сборную трубку.

7. Добавить 500 мкл промывочного буфера 1, центрифугировать 1 минуту при 10000 об/мин.

8. Удалить сборную трубку и поместить спин-колонку в чистую сборную

трубку.

1. Добавить 500 мкл промывочного буфера 2 центрифугировать на максимальной скорости 3 минуты.

2. Удалить сборную трубку и поместить спин-колонку в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.

3. Добавить 50 мкл элюирующего раствора, пробирки инкубировать 1 мин. при комнатной температуре. Центрифугировать при максимальной скорости 1 минуту. Пробирка содержит очищенную геномную ДНК.

Если исследования с ДНК будут продолжены непосредственно после выделения, очищенную ДНК хранят в холодильнике при температуре 4 °C. Для более продолжительного хранения ДНК необходимо заморозить при температуре 20 °C.

Выделение ДНК методом осаждения на магнитных частицах. Использование магнитных твёрдых носителей в биохимических и молекулярнобиологических процессах имеет ряд преимуществ по сравнению с другими немагнитными методами выделения нуклеиновых кислот. Основной принцип заключается в том, что частицы, обладающие магнитным моментом, могут быть извлечены из раствора при наложении магнитного поля, например, при использовании постоянного магнита. Данный метод является быстрым, простым и эффективным для разделения частиц после связывания с нуклеиновыми кислотами или на стадии элюирования. Таким же образом можно изолировать компоненты разрушенных клеток, которые ингибируют ДНК-полимеразу в ПЦР. Основными ингибиторами ПЦР являются ионы кальция, полисахариды, фенольные соединения, гумусовые вещества, белки (коллаген, гемоглобин, иммуноглобулин) [305]. Ингибиторы могут находиться в биологическом материале, а могут быть добавлены в процессе обработки образца или выделения нуклеиновой кислоты. Такими веществами могут быть порошок из перчаток [305], различные соли (например, хлориды натрия и