калия), а также органические молекулы (например, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), этанол, изопропиловый спирт или фенол) [306].

Материалы для изготовления магнитных частиц различны: синтетические полимеры, пористое стекло или магнитные частицы из неорганических магнитных материалов, например, поверхностно-модифицированный оксид железа. Особенно популярными являются суперпарамагнитные частицы, которые не взаимодействуют между собой в отсутствии магнитного поля. Данные частицы будут магнититься только в магнитном поле, а после удаления из него будут терять магнетизм.

Для автоматического выделения нуклеиновых кислот используются магнитные частицы со стеклянным покрытием [307]. Метод удобен, технологичен и пригоден для подготовки образца к амплификации, его можно воспроизвести на роботизированных пипеттирующих рабочих станциях. Однако возможны потери продукта вследствие необратимой сорбции на носителе, а также в процессе многочисленных отмывок. Особенно большое значение это имеет при работе с небольшими количествами ДНК в образце [308].

Преимуществами автоматического выделения нуклеиновых кислот являются высокая скорость выделения нуклеиновых кислот, по сравнению с другими данный метод является менее трудоемким, высокие выход и чистота продукта, достоверность результата за счет исключения ошибок, связанных с человеческим фактором.

Выделение ДНК методом осаждения на магнитных частицах можно провести с помощью автоматизированной системы для выделения нуклеиновых кислот из клеток Automate Express DNA extraction system (рисунок 7), используя набор реагентов Charge Switch Forensic DNA Purification Kit (Life technologies, Invitrogen (рисунок 8)).

Выделение ДНК на автоматизированной системе Automate Express DNA extraction system коммерческим набором Charge Switch Forensic DNA Purification Kit

Состав набора:

• лизирующий буфер;

• протеиназа К;

• картриджи;

• наконечники;

• элюирующие пробирки;

• пробирки 1,5 мл.

Необходимое оборудование и материалы: ПЦР-бокс, водяная баня либо твердотельный термостат для микропробирок, вортекс (прибор для встряхивания и перемешивания), дозаторы с переменным объемом: 10-100 мкл и 200-1000 мкл), пробирки типа «Eppendorf» 1.5 мл, штативы для микропробирок, емкости для отходов.

Ход работы:

1. Установить водяную баню или термостат при температуре 55 ° С.

2. Подготовка лизис-микса: на каждый образец смешать 1 мл лизирующего буфера и 10 мкл протеиназы K.

3. Добавить 1 мл лизис-микса в пробирку.

4. Добавить биоматериал к лизис-миксу, убедившись, что образцы были полностью погружены в смесь; перемешивать в течение 10-15 секунд.

5. Инкубировать образцы в течение одного часа при температуре 55 ° C.

6. Удалить нерастворившийся материал одноразовым пинцетом или переместить лизат в новую пробирку.

1. Запустить автоматизированную систему Automate Express DNA extraction system, включив кнопку питания.

2. Открыть дверцу инструмента (нажав на дверь); затем снять стойку для картриджа.

3. Загрузить картридж в стойку так, чтобы он защелкнулся. Необходимо убедиться в том, что выемки в картридже совпадают с вырезами в стойке для картриджей. Если необходимо обработать менее 13 образцов, можно оставить пустые слоты в стойке.

4. Загрузить пробирки с элюирующим раствором и пробирки для ДНК в

стойку:

• загрузить первый ряд (обозначенный как E) элюирующими пробирками;

• второй ряд (обозначенный как T1) оставить пустым;

• загрузить третий ряд (обозначенный как T2) наконечниками iPrep ™;

• загрузить четвертый ряд (обозначенный как S) пробирками без

• колпачков, содержащих лизат (~ 1 мл).

Если необходимо обработать менее 13 образцов, наконечники и пробирки загружают в тех же положениях, что и картриджи.

1. Вставить стойку с картриджами, а также стойку с наконечниками с пробирками в прибор Automate Express DNA extraction system. Закрыть дверцу инструмента.

2. Нажать «Пуск» на главном экране.

3. Убедиться, что отображается имя используемого набора реагентов

Charge Switch Forensic DNA Purification Kit.

1. Следовать инструкциям на экране, затем нажать «Старт».

2. В конце прогона инструмент подаст короткий звуковой сигнал.

3. Открыть дверцу инструмента. Удалить и закрыть элюирующие пробирки, содержащие очищенную нуклеиновую кислоту.

Если исследования с ДНК будут продолжены непосредственно после выделения, очищенную ДНК хранят в холодильнике при температуре 4 °C. Для более продолжительного хранения ДНК необходимо заморозить при температуре 20 °C.

Контрольные вопросы

• 1.Каковы принципы отбора биологического материала?

• Порядок взятия крови крупного рогатого скота.

• Каковы основные этапы выделения и очистки нуклеиновых кислот при

использовании колоночного метода?

4. Заполнить таблицу «Методы выделения ДНК»

1. Выделить ДНК из крови крупного рогатого скота колоночным методом.

70