3.2 Качественная и количественная оценка ДНК

Измерение концентрации нуклеиновых кислот является рутинной практикой во многих молекулярно-биологических лабораториях. Определение концентрации и качества препарата нуклеиновых кислот – один из ключевых начальных шагов в экспериментах, включающих ПЦР, секвенирование и др. Для оценки качества и концентрации нуклеиновых кислот в лабораторной практике используют качественные и количественные методы. Качественный метод оценки концентрации нуклеиновых кислот основан на проведении электрофоретического разделения в агарозном геле препарата нуклеиновой кислоты и контрольного образца с известной концентрацией (например, коммерческий маркер размерности ДНК). При этом для более точного определения количества нуклеиновой кислоты используют стандартное разведение контрольного образца. Качество ДНК оценивается по наличию четкого, или не четкого бэнда или его отсутствию. При отсутствии деградации ДНК выявляют четкую дискретную полосу. При наличии деградации той или иной степени на дорожке наблюдают несколько фрагментов ДНК различной молекулярной массы. При недостаточной очистке препарата ДНК от белковых фракций, на электрофореграмме наблюдается «шмер» ниже расположения полосы, соответствующей ДНК.

Достоинством этого метода является то, что кроме оценки наличия и концентрации выделенной ДНК имеется возможность установить величину фрагментов выделенной ДНК, т.е. оценить степень ее деградации. К недостаткам метода следует отнести относительно невысокую чувствительность метода, кроме того, при выделении ДНК из объектов, загрязненных бактериальной микрофлорой, не представляется возможным отличить ДНК животного от бактериальной ДНК, что может привести к ошибочному занижению количества ДНК, вносимого в реакционную смесь при постановке реакции амплификации, и соответственно к неудовлетворительному результату.

Проведение электрофореза на агарозном геле

Необходимые реактивы: агароза, ТБЕ-буфер, дистиллированная вода, краска для электрофореза

Необходимое оборудование и материалы: микроволновая печь, камера для горизонтального электрофореза, заливочный столик с гребенками, источник тока, трансиллюминатор для агарозно-этидиевых гелей, дозаторы с переменным объемом 2-10 мкл, наконечники для дозаторов объемом 2-10 мкл, мерный стакан объемом 100 мл, лента лабораторная «Parafilm M», спирт для обработки столешницы и инструментов, емкости для отходов.

Ход работы:

1. Приготовить 10 %-ный раствор ТБЕ-буфера. Для этого в мерный стакан на 100 мл налить 90 мл дистиллированной воды, добавить туда 10 мл ТБЕбуфера и хорошо перемешать.

2. Приготовить агарозу. К готовому раствору ТБЕ буфера добавить 0,5-1,5 г агарозы и перемешать. Гель варить в микроволновой печи при мощности 500 В – 1 мин (Не использовать фольгу в качестве крышки для стакана!!!) или на водяной бане, на плитке до полного растворения крупинок агарозы. При этом не допускается перегревание и закипание раствора.

3. Остудить гель до 60–50°С, добавить 8 мкл краски и залить в заливочную форму (как правило, размер геля 15×10 см), использовать гребенку, которая формирует карман объемом до 20 мкл.

4. Подготовить пробы ДНК – на ленту «Parafilm M», нанести 2 мкл красителя, к каплям красителя добавить 5 мкл ДНК, перемешать пипетированием.

5. После застывания геля пробы нанести в отдельные карманы. В одну лунку для контроля качества выделенной ДНК вносят маркер молекулярной массы «рGЕМ DNАmarker». Электрофорез проводить 15 мин при 80-100 В.

6. Рассмотреть гель с помощью трансиллюминатора в УФ-свете

В случае успешного проведения работы в трансиллюминаторе в УФ-лучах (290–330 нм) на электрофореограмме можно будет увидеть дорожки с продуктом гидролиза ДНК. Не включать трансиллюминатор без закрытого защитного щитка или очков во избежание во избежание ожога роговицы глаз.

Количественный (спектрофотометрический) метод оценки концентрации нуклеиновых кислот основан на их способности поглощать ультрафиолетовый свет при определенной длине волны. Белки и нуклеиновые кислоты поглощают свет в ультрафиолетовом спектре в пределах длин волн между 210 и 300 нм. Для определения количества ДНК или РНК измеряют поглощение раствора в областях с длинами волн 260 и 280 нм. Для оценки качества (содержания примесей) препарата нуклеиновых кислот используют отношение А260/А280, которое для чистого препарата ДНК приблизительно равно 1,8, а для РНК – примерно 2,0. Важно отметить тот факт, что примеси РНК в растворе ДНК не могут быть выявлены методом спектрофотометрии.

Современные спектрофотометры рассчитывают концентрацию нуклеиновых кислот автоматически с использованием специального программного обеспечения. В настоящее время существуют как обычные кюветные, так и спектрофотометры для микрообъёмов, позволяющие проводить измерения в объёмах 0,5-2,0 мкл. При этом измерение производится непосредственно в капле жидкости, которую наносят на неподвижный модуль прибора. Сверху на каплю опускают подвижный модуль прибора, в результате чего из образца формируется столбик жидкости между подвижным и

неподвижным модулями. Прибор измеряет поглощение света в столбике образца.

Измерение концентрации ДНК с помощью спектрофотометра Dynamica Halo DNAmaster

Необходимые реактивы: пробы ДНК, элюирующий раствор

Необходимое оборудование и материалы: спектрофотометр Dynamica Halo DNAmaster, дозаторы с переменным объемом (1–10 мкл), наконечники для дозаторов (1–10 мкл), безволокнистые тампоны или салфетки, спирт для обработки столешницы и инструментов, емкости для отходов.

Ход работы:

1. Включить прибор, выбрать необходимый режим измерения с помощью кнопок на экране.

2. Выбрать необходимую крышку для кюветы. Измерение ДНК проводят с кюветой 1 мм (factor 10) – для измерения концентрации ДНК в пределах от 13 до 850 нг/мкл или с кюветой 0,2 мм (factor 50) – для измерения концентрации ДНК в пределах от 63 до 4250 нг/мкл.

3. Перед измерением концентрации ДНК необходимо на кювету нанести 4 мкл элюирующего раствора. Кювету закрыть крышкой, установить в держатель. На приборе нажать кнопку «Zero».

4. Остаток раствора на кювете убрать при помощи безволокнистых тампонов или салфеток.

5. Нанести на кювету 4 мкл образца ДНК, закрыть крышкой, установить в держатель. На приборе нажать кнопку «Read». На экране прибора будет выдана концентрация ДНК в нг/мкл и чистота (А260/280).

6. Остаток раствора на кювете убрать при помощи безволокнистых тампонов или салфеток.

7. Повторить пункт 5 с другим образцом. При определении концентрации большого количества образцов ДНК результаты необходимо периодически сбрасывать элюирующим раствором (например, после каждого 5-го измерения).