Измерение концентрации ДНК с помощью Qubit® 3.0 Fluorometer

Необходимые реактивы: пробы ДНК, стандарты № 1 и № 2 для проведения анализа на Qubit, буфер для проведения анализа на Qubit, реагент для проведения анализа на Qubit.

Необходимое оборудование и материалы: Qubit® 3.0 Fluorometer, вортекс, микропробирки 0.5 мл, дозаторы с переменным объемом (1–10 мкл, 10–100 мкл, 100–1 000 мкл), наконечники для дозаторов (1–10 мкл, 10–100 мкл, 100–1 000 мкл), пробирки типа «Eppendorf» объемом 1.5 мл, штативы для микропробирок, спирт для обработки столешницы и инструментов, емкости для отходов.

Ход работы:

1. Приготовить смесь для определения концентрации ДНК. Рассчитать необходимое количество реактивов по формулам:

2. N образцов ДНК + 2 (мкл) – для реагента Qubit;

3. (N образцов ДНК + 2)*199 - для буфера Qubit.

4. Перемешать буфер с реагентом на вортексе.

5. В пробирку добавить 190 мкл готовой смеси и 10 мкл стандарта № 1. Перемешать на вортексе.

6. В пробирку добавить 190 мкл готовой смеси и 10 мкл стандарта № 2. Перемешать на вортексе.

7. В пробирку добавить 190 мкл готовой смеси и 10 мкл образца ДНК. Перемешать на вортексе.

8. Далее на Qubit, пошагово следуя инструкции на приборе, определить концентрацию ДНК для каждого образца. Включить прибор, → выбрать тип измеряемых молекул ДНК и набор (HS/BR); → провести калибровку (New calibration), → внести в прибор стандарт 1, затем стандарт 2, → далее измерить образцы, для расчета концентрации в исходном образце, необходимо указать

количество внесенного образца.

Контрольные вопросы:

1. В чем принцип метода спектрофотометрического определения концентрации нуклеиновых кислот?

2. При какой длине волны оценивают концентрацию ДНК спектрофотометрическим методом: а) 260нм и 280нм; б) 280нм и 300нм; в) 180нм и 280нм; г) 200нм и 350нм.

3. Какая масса агарозы необходима для приготовления 150 мл 2.5%-ного геля?

4. Приготовить 1 % агарозный гель для проведения гель-электрофореза. Растворить 1 г агарозы в 99 мл 1хТВЕ (1 % гель). Нагреть до 100 °С для растворения агарозы, постоянно перемешивая раствор, и медленно охладить до 40–50 °С. Добавить в раствор агарозы бромистый этидий. Затем с помощью специальной кюветы и гребенки сформировать гель с лунками.

5. Определить качество выделенной ДНК методом электрофореза.

3.3 Проведение ПЦР-ПДРФ для генов молочных белков

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим рестрикционным анализом является стандартным анализом точковых мутаций для диагностики аллельного полиморфизма генов-кандидатов, связанных с продуктивными качествами сельскохозяйственных животных. По длине фрагментов (ПДРФ) делают вывод об отсутствии или наличии точковой мутации, а также о гомозиготности или гетерозиготности особи [309].

Метод ПЦР-ПДРФ дал возможность идентифицировать генотипы белков молока на ранних стадиях развития животного, что значительно ускоряет решение некоторых актуальных задач современной селекции. Использование ПЦР облегчает процедуру анализа и открывает возможность массовых исследований ДНК сельскохозяйственных животных и проведения

75

практической селекции на уровне генотипов. Преимущество генной диагностики объясняется тем, что она базируется непосредственно на анализе наследственной информации, лежащей в основе того или иного признака [310]. Широкое применение метода ПЦР ускорило и упростило диагностику точковых мутаций, которые являются причиной полиморфизма большинства генов белков молока. Высокая чувствительность метода позволяет определить аллели, различающиеся заменой лишь одного полиморфизма большинства генов белков молока [310].

3.3.1 Постановка ПЦР-ПДРФ для гена каппа-казеина ( bCSN3 )

Проведение амплификации гена каппа-казеина bCSN3

Необходимые реактивы: пробы ДНК, буферный раствор, деоионизированная вода, хлорид магния, Taq-полимераза, дезоксинуклеозидтрифосфаты (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), праймеры для исследуемого участков гена bCSN3 .

Необходимое оборудование и материалы: ПЦР-бокс, вортекс, холодильник с морозильной камерой на –20°С, амплификатор, дозаторы с переменным объемом (0,1–10 мкл, 1–10 мкл, 10–100 мкл, 100–1 000 мкл), наконечники для дозаторов (0,1–10 мкл, 1–10 мкл, 10–100 мкл, 100–1 000 мкл), пробирки типа «Eppendorf» объемом 1,5 мл, микропробирки пластиковые с плоской крышкой типа «Eppendorf» объемом 0,2 или 0,5 мл соответственно амплификатору, штативы для микропробирок, спирт для обработки столешницы и инструментов, емкости для отходов.

Ход работы:

1. Для установления генотипов крупного рогатого скота по локусу каппаказеина используют следующие праймеры [311]: VAR5: 5′-atagccaaatatatcccaattcag t-3′;

VAR3: 5′-tttattaataagtccatgaatctt g-3′.

1. Приготовить реакционную смесь для проведения ПЦР. Смесь без ДНК матрицы приготовить в одной пробирке и затем аликвотировать по индивидуальным.

На 1 реакцию понадобится 18,5 мкл реакционной смеси. Необходимо взять:

– 0,5 мкл смеси dNTP;

– 2 мкл реакционного буфера;

– 1,5 мкл прямого и 1,5 мкл обратного праймеров;

• 1,8 мкл хлорида магния;

• 0,3 мкл Taq-полимеразы;

• 10,9 мкл деионизованной воды.