Перемешать все компоненты. Taq-полимеразу добавить в последнюю очередь, вынув ее из морозильной камеры холодильника и поместив на лед.

1. Полученную реакционную смесь раскапать в подготовленные пробирки.

2. Добавить в каждую пробирку, кроме пробирки с отрицательным контролем, по 1,5 мкл матричной ДНК.

3. Поместить пробирки в амплификатор и запустить соответствующий режим, который должен соответствовать праймерам, используемым в реакции. Режим амплификации:

1 95°С – 5 мин;

1. 94°С – 60 с;

2. 58°С – 60 с;

3. 72°С – 60 с;

4. Стадии 2–4 повторяются 35 раз;

5. 72°С – 5 мин.

6. Если образцы не анализируются сразу после окончания амплификации, их следует поместить в холодильник на –20°С.

Рестрикционный анализ гена каппа-казеина bCSN3

Необходимые реактивы: амплификат, рестриктаза HindIII, рестрикционный буфер «W» с добавлением BSA (СибЭнзим, Россия), бидистиллированная вода, 6×DNA Loading Dye (краситель – 6×MassRuler™, раствор с красителями для нанесения образцов на гель), раствор бромистого этидия, маркер молекулярных масс 50 п.н., агароза, 10×ТБЕ буфер.

Необходимое оборудование и материалы: ПЦР-бокс, вортекс, камера для электрофореза, заливочный столик с гребенками, микроволновая печь или плитка, источник тока, трансиллюминатор для агарозно-этидиевых гелей, холодильник с морозильной камерой на –20°С, амплификатор, дозаторы с переменным объемом (0,1–10 мкл, 1–10 мкл, 10–100 мкл, 100–1000 мкл), наконечники для дозаторов (0,1–10 мкл, 1–10 мкл, 10–100 мкл, 100–1 000 мкл), мерный стакан (100 мл – 1 шт., 1000 мл – 1 шт.), пробирки типа «Eppendorf» объемом 1,5 мл, микропробирки пластиковые с плоской крышкой типа «Eppendorf» объемом 0,2 или 0,5 мл соответственно амплификатору, штативы для микропробирок, лента лабораторная «Parafilm M», спирт для обработки столешницы и инструментов, емкости для отходов.

Ход работы:

1. Обработать 10 мкл полученного амплификата 20 ед. эндонуклеазой рестрикции HindIII в 1хбуфере «W» с добавлением BSA (СибЭнзим, Россия).

2. Полученную смесь перемешать на вортексе и инкубировать в термостате в течение 8 часов при 37°С. Все операции проводить на лабораторном столе,

ферменты либо поместить в лед, либо кратковременно извлекать из морозильной камеры.

1. Приготовить 2%-ный агарозный гель для проведения электрофореза.

2. Нанести на гель рестрикцированные образцы, маркер молекулярных масс.

3. Рассмотреть гель с помощью трансиллюминатора в УФ-свете. Фрагменты разделяются в 2% агарозном геле и визуализируются в УФ после окрашивания бромистым этидием (рисунок 11).

М- маркер молекулярного веса;

1, 2, 3 –генотипы АА;

4 - генотип ВВ;

5 – генотип АВ;

Рисунок 11 - Результаты рестрикции амплификатов с использованием эндонуклеазы HindIII.

Аллель А не имеет сайта рестрикции, поэтому после рестрикции А – аллелей изначальный ПЦР продукт остается неизменным (рис. 1). Аллель В имеет сайт рестрикции для рестриктазы HindIII, поэтому в результате рестрикции образуются два фрагмента: 377 и 155 п.н. Присутствие в образце трех фрагментов свидетельствует о гетерозиготном генотипе АВ (рис. 1).

Контрольные вопросы

1. Из каких компонентов состоит реакционная смесь?

2. Составьте реакционную смесь по гену каппа-казеина bCSN3 , которая готовится в объеме 18,5 мкл и содержит 2 мкл 1xTaq-буфера, 0,5 мкл дНТФ (dNTP’s), 1,8 мкл MgCL2, 1,5 мкл каждого праймера, 0,3 мкл Taq-полимеразы, 0,5 мкл геномной ДНК.

3. Проведите постановку ПЦР, используя программу: «горячий старт» – 5 минут при 95 °С; 35 циклов: денатурация – 60 секунд при 94 °С, отжиг – 60 секунд при 58 °С, синтез – 1 минута при 72 °С; достройка – 5 минут при 72 °С.

1. Приготовьте 2 % агарозный гель для проведения гель-электрофореза: – растворите 2 г агарозы в 100 мл 10 %-ном растворе 1хТВЕ. Нагрейте до 100 °С для растворения агарозы, постоянно перемешивая раствор, и медленно охладите до 40–50 °С. Добавьте в раствор агарозы бромистый этидий. Затем с помощью специальной кюветы и гребенки сформируйте гель с лунками.

2. Проведите визуализацию амплификата по гену каппа-казеина bCSN3 методом горизонтального электрофореза. Детекция результатов амплификации по гену bCSN3 : 8 мкл продукта амплификации + 0,5 мкл красителя раскапать в 2 % агарозный гель (110 W, 30–35 мин.). Длина амплифицированного фрагмента: 532 п.н. Для электрофореза используется 1хТВЕ буфер. Визуализация и анализ результатов осуществляются на системе гельдокументации.

3.3.2 Постановка ПЦР-ПДРФ для гена альфа-лактальбумина ( bLALBA )

Проведение амплификации гена альфа-лактальбумина ( bLALBA )

Необходимые реактивы: пробы ДНК, буферный раствор, деоионизированная вода, хлорид магния, Taq-полимераза, дезоксинуклеозидтрифосфаты (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), праймеры для исследуемого участков гена bLALBA .

Необходимое оборудование и материалы: ПЦР-бокс, вортекс, холодильник с морозильной камерой на –20°С, амплификатор, дозаторы с переменным объемом (0,1–10 мкл, 1–10 мкл, 10–100 мкл, 100–1 000 мкл), наконечники для дозаторов (0,1–10 мкл, 1–10 мкл, 10–100 мкл, 100–1 000 мкл), пробирки типа «Eppendorf» объемом 1,5 мл, микропробирки пластиковые с плоской крышкой типа «Eppendorf» объемом 0,2 или 0,5 мл соответственно амплификатору, штативы для микропробирок, спирт для обработки столешницы и инструментов, емкости для отходов.

Ход работы:

1. Для установления генотипов крупного рогатого скота по локусу альфалактальбумина используют следующие праймеры

ALF-LAC1: 5′- aagagttggatggaatcacc -3′;

ALF-LAC2: 5′- ttcaaattgctggcatcaagc -3′ [52].

1. Приготовить реакционную смесь для проведения ПЦР. Смесь без ДНК матрицы приготовить в одной пробирке и затем аликвотировать по индивидуальным.

На 1 реакцию понадобится 20 мкл реакционной смеси. Необходимо взять:

– 2 мкл смеси dNTP;

– 2 мкл реакционного буфера;