Выделение ДНК на автоматизированной системе Automate Express DNA extraction system коммерческим набором Charge Switch Forensic DNA Purification Kit
Состав набора:
-
лизирующий буфер;
-
протеиназа К;
-
картриджи;
-
наконечники;
-
элюирующие пробирки;
-
пробирки 1,5 мл.
Необходимое оборудование и материалы: ПЦР-бокс, водяная баня либо твердотельный термостат для микропробирок, вортекс (прибор для встряхивания и перемешивания), дозаторы с переменным объемом: 10-100 мкл и 200-1000 мкл), пробирки типа «Eppendorf» 1.5 мл, штативы для микропробирок, емкости для отходов.
Ход работы:
-
Установить водяную баню или термостат при температуре 55 ° С.
-
Подготовка лизис-микса: на каждый образец смешать 1 мл лизирующего буфера и 10 мкл протеиназы K.
-
Добавить 1 мл лизис-микса в пробирку.
-
Добавить биоматериал к лизис-миксу, убедившись, что образцы были полностью погружены в смесь; перемешивать в течение 10-15 секунд.
-
Инкубировать образцы в течение одного часа при температуре 55 ° C.
-
Удалить нерастворившийся материал одноразовым пинцетом или переместить лизат в новую пробирку.
-
Запустить автоматизированную систему Automate Express DNA extraction system, включив кнопку питания.
-
Открыть дверцу инструмента (нажав на дверь); затем снять стойку для картриджа.
-
Загрузить картридж в стойку так, чтобы он защелкнулся. Необходимо убедиться в том, что выемки в картридже совпадают с вырезами в стойке для картриджей. Если необходимо обработать менее 13 образцов, можно оставить пустые слоты в стойке.
-
Загрузить пробирки с элюирующим раствором и пробирки для ДНК в
стойку:
-
загрузить первый ряд (обозначенный как E) элюирующими пробирками;
-
второй ряд (обозначенный как T1) оставить пустым;
-
загрузить третий ряд (обозначенный как T2) наконечниками iPrep ™;
-
загрузить четвертый ряд (обозначенный как S) пробирками без
-
колпачков, содержащих лизат (~ 1 мл).
Если необходимо обработать менее 13 образцов, наконечники и пробирки загружают в тех же положениях, что и картриджи.
-
Вставить стойку с картриджами, а также стойку с наконечниками с пробирками в прибор Automate Express DNA extraction system. Закрыть дверцу инструмента.
-
Нажать «Пуск» на главном экране.
-
Убедиться, что отображается имя используемого набора реагентов
Charge Switch Forensic DNA Purification Kit.
-
Следовать инструкциям на экране, затем нажать «Старт».
-
В конце прогона инструмент подаст короткий звуковой сигнал.
-
Открыть дверцу инструмента. Удалить и закрыть элюирующие пробирки, содержащие очищенную нуклеиновую кислоту.
Если исследования с ДНК будут продолжены непосредственно после выделения, очищенную ДНК хранят в холодильнике при температуре 4 °C. Для более продолжительного хранения ДНК необходимо заморозить при температуре 20 °C.
Контрольные вопросы
-
1.Каковы принципы отбора биологического материала?
-
Порядок взятия крови крупного рогатого скота.
-
Каковы основные этапы выделения и очистки нуклеиновых кислот при
использовании колоночного метода?
4. Заполнить таблицу «Методы выделения ДНК»
| Метод выделения | Этапы выделения | Преимущества | Недостатки |
|---|---|---|---|
| метода | метода |
- Выделить ДНК из крови крупного рогатого скота колоночным методом.
70
3.2 Качественная и количественная оценка ДНК
Измерение концентрации нуклеиновых кислот является рутинной практикой во многих молекулярно-биологических лабораториях. Определение концентрации и качества препарата нуклеиновых кислот – один из ключевых начальных шагов в экспериментах, включающих ПЦР, секвенирование и др. Для оценки качества и концентрации нуклеиновых кислот в лабораторной практике используют качественные и количественные методы. Качественный метод оценки концентрации нуклеиновых кислот основан на проведении электрофоретического разделения в агарозном геле препарата нуклеиновой кислоты и контрольного образца с известной концентрацией (например, коммерческий маркер размерности ДНК). При этом для более точного определения количества нуклеиновой кислоты используют стандартное разведение контрольного образца. Качество ДНК оценивается по наличию четкого, или не четкого бэнда или его отсутствию. При отсутствии деградации ДНК выявляют четкую дискретную полосу. При наличии деградации той или иной степени на дорожке наблюдают несколько фрагментов ДНК различной молекулярной массы. При недостаточной очистке препарата ДНК от белковых фракций, на электрофореграмме наблюдается «шмер» ниже расположения полосы, соответствующей ДНК.
Достоинством этого метода является то, что кроме оценки наличия и концентрации выделенной ДНК имеется возможность установить величину фрагментов выделенной ДНК, т.е. оценить степень ее деградации. К недостаткам метода следует отнести относительно невысокую чувствительность метода, кроме того, при выделении ДНК из объектов, загрязненных бактериальной микрофлорой, не представляется возможным отличить ДНК животного от бактериальной ДНК, что может привести к ошибочному занижению количества ДНК, вносимого в реакционную смесь при постановке реакции амплификации, и соответственно к неудовлетворительному результату.
Проведение электрофореза на агарозном геле
Необходимые реактивы: агароза, ТБЕ-буфер, дистиллированная вода, краска для электрофореза
Необходимое оборудование и материалы: микроволновая печь, камера для горизонтального электрофореза, заливочный столик с гребенками, источник тока, трансиллюминатор для агарозно-этидиевых гелей, дозаторы с переменным объемом 2-10 мкл, наконечники для дозаторов объемом 2-10 мкл, мерный стакан объемом 100 мл, лента лабораторная «Parafilm M», спирт для обработки столешницы и инструментов, емкости для отходов.
