Выделение ДНК с использованием коммерческого набора «Pure Link Genomic DNA Kits»

Состав набора:

• колонки PureLink® Spin Column;

• сборные трубки;

• пробирки 1.5 мл;

• протеиназа К;

• РНКаза A;

• лизирующий раствор;

• промывочный буфер 1;

• промывочный буфер 2;

• элюирующий раствор.

Необходимое оборудование и материалы: ПЦР-бокс, водяная баня либо твердотельный термостат для микропробирок, микроцентрифуга для микропробирок (скорость вращения не менее 10000 об/мин), вортекс (прибор для встряхивания и перемешивания, дозаторы с переменным объемом: 10-100 мкл и 200-1000 мкл), пробирки типа «Eppendorf» 1.5 мл, штативы для микропробирок, емкости для отходов.

Ход работы:

1. Установить водяную баню или термостат при температуре 55 ° С.

2. Добавить 200 мкл крови в микропробирки Pure Link с фильтром, при этом на дозаторы лучше надевать наконечники с фильтром, так как кровь может содержать посторонние примеси.

3. Добавить 20 мкл протеиназы K в образец для лизирования клетки.

4. Добавить 20 мкл РНКазы А, смешать, инкубировать 2 минуты при комнатной температуре.

1. Добавить 200 мкл лизирующего раствора и хорошо перемешать на

вортексе, чтобы получить гомогенный раствор.

1. Инкубировать при 55 ° C в течение 10 минут.

2. Добавить 200 мкл 96-100% этанола в лизат и хорошо перемешать.

3. Извлечь колонку PureLink® Spin Column в сборную трубку из упаковки.

4. Добавить лизат (~ 640 мкл) в колонку PureLink®.

5. Центрифугировать колонку при 10000 об/мин в течение 1 минуты при комнатной температуре.

6. Удалить сборную трубку и поместить спин-колонку в чистую сборную трубку.

7. Добавить 500 мкл промывочного буфера 1, центрифугировать 1 минуту при 10000 об/мин.

8. Удалить сборную трубку и поместить спин-колонку в чистую сборную

трубку.

1. Добавить 500 мкл промывочного буфера 2 центрифугировать на максимальной скорости 3 минуты.

2. Удалить сборную трубку и поместить спин-колонку в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.

3. Добавить 50 мкл элюирующего раствора, пробирки инкубировать 1 мин. при комнатной температуре. Центрифугировать при максимальной скорости 1 минуту. Пробирка содержит очищенную геномную ДНК.

Если исследования с ДНК будут продолжены непосредственно после выделения, очищенную ДНК хранят в холодильнике при температуре 4 °C. Для более продолжительного хранения ДНК необходимо заморозить при температуре 20 °C.

Выделение ДНК методом осаждения на магнитных частицах. Использование магнитных твёрдых носителей в биохимических и молекулярнобиологических процессах имеет ряд преимуществ по сравнению с другими немагнитными методами выделения нуклеиновых кислот. Основной принцип заключается в том, что частицы, обладающие магнитным моментом, могут быть извлечены из раствора при наложении магнитного поля, например, при использовании постоянного магнита. Данный метод является быстрым, простым и эффективным для разделения частиц после связывания с нуклеиновыми кислотами или на стадии элюирования. Таким же образом можно изолировать компоненты разрушенных клеток, которые ингибируют ДНК-полимеразу в ПЦР. Основными ингибиторами ПЦР являются ионы кальция, полисахариды, фенольные соединения, гумусовые вещества, белки (коллаген, гемоглобин, иммуноглобулин) [305]. Ингибиторы могут находиться в биологическом материале, а могут быть добавлены в процессе обработки образца или выделения нуклеиновой кислоты. Такими веществами могут быть порошок из перчаток [305], различные соли (например, хлориды натрия и

калия), а также органические молекулы (например, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), этанол, изопропиловый спирт или фенол) [306].

Материалы для изготовления магнитных частиц различны: синтетические полимеры, пористое стекло или магнитные частицы из неорганических магнитных материалов, например, поверхностно-модифицированный оксид железа. Особенно популярными являются суперпарамагнитные частицы, которые не взаимодействуют между собой в отсутствии магнитного поля. Данные частицы будут магнититься только в магнитном поле, а после удаления из него будут терять магнетизм.

Для автоматического выделения нуклеиновых кислот используются магнитные частицы со стеклянным покрытием [307]. Метод удобен, технологичен и пригоден для подготовки образца к амплификации, его можно воспроизвести на роботизированных пипеттирующих рабочих станциях. Однако возможны потери продукта вследствие необратимой сорбции на носителе, а также в процессе многочисленных отмывок. Особенно большое значение это имеет при работе с небольшими количествами ДНК в образце [308].

Преимуществами автоматического выделения нуклеиновых кислот являются высокая скорость выделения нуклеиновых кислот, по сравнению с другими данный метод является менее трудоемким, высокие выход и чистота продукта, достоверность результата за счет исключения ошибок, связанных с человеческим фактором.

Выделение ДНК методом осаждения на магнитных частицах можно провести с помощью автоматизированной системы для выделения нуклеиновых кислот из клеток Automate Express DNA extraction system (рисунок 7), используя набор реагентов Charge Switch Forensic DNA Purification Kit (Life technologies, Invitrogen (рисунок 8)).