Контрольные вопросы

1. Проведите хронологию происходящих процессов: а) приготовление рестрикционной смеси для ПЦР; б) выделение ДНК; в) постановка ПДРФанализа; г) постановка ПЦР; д) визуализация полученного продукта и статистическая обработка результатов

2. Каков механизм действия ферментов рестрикции ДНК?

3. Из скольких стадий состоит ПДРФ-анализ?

4. Последовательность в молекуле ДНК, в месте расположения которой рестрикционная нуклеаза разрезает: а) сайт узнавания; б) сайт прикрепления; в) сайт рестрикции; г) специфический сайт

5. Соотнесите термины и понятия:

3.1 Пробоподготовка и выделение ДНК из образца

Взятие биологического материала. При отборе материала необходимо соблюдать меры, предупреждающие заражение людей, контаминирование объектов внешней среды, возможность переноса возбудителя от одной пробы к другой. Трудность исключения контаминации заключается в том, что инактивированные микроорганизмы остаются источниками нуклеиновых кислот, поэтому обработка, например, рук, инструментов спиртом не предотвратит контаминации проб посторонней ДНК.

Один из основных принципов предотвращения контаминации - аккуратность. Необходимо следить за тем, чтобы инструменты, руки и прочие поверхности, соприкасающиеся с биоматериалом, пробой, не контактировали с другой пробой либо чистыми посудой, инструментами, руками.

Другой принцип - использование одноразовой, пластиковой посуды, контейнеров и перчаток.

Третий принцип - разрушение нуклеиновых кислот на поверхностях инструментов, мебели. Инструменты, перед отбором очередной пробы необходимо очищать и обжигать над пламенем спиртовки. Помещение пред началом работы желательно обрабатывать ультрафиолетовым излучением в течение часа. После работы помещение, мебель и инструменты желательно очистить от остатков биоматериала. Инструменты, стеклянную посуду, кюветы можно залить 5% раствором хлорамина, после чего удалить хлорамин стерильной дистиллированной водой. Для мытья кювет можно использовать автоклавированную тряпку.

Четвертый принцип - сохранение нуклеиновых кислот в пробе от разрушающего действия нуклеаз (ферментов, разрушающих нуклеиновые кислоты). На стадии отбора биоматериала, его хранения и транспортировки, данный принцип реализуется путем создания неблагоприятных для работы нуклеаз условий - замораживание, либо высушивание проб [301].

1. Отбор цельной крови. У крупного рогатого скота кровь отбирают из ярёмной или хвостовой вены в объёме не менее 5 мл одноразовой иглой (диаметр 0,8 - 1,1 мм) в специальную вакуумную систему типа "Vacuett" (сиреневые крышки - 6% ЭДТА) или одноразовым шприцем в пластиковые пробирки с цитратом натрия (3,8% раствор цитрата натрия в соотношении 1:9). Перед взятием крови иглы необходимо простерилизовать кипячением. Кровь от каждого животного берут индивидуальной иглой. Место взятия крови тщательно дезинфицируют спиртом или 5% раствором йода. После взятия крови пробирку следует плавно несколько раз перевернуть вверх дном, чтобы кровь в пробирке тщательно перемешалась с антикоагулянтом (в противном случае кровь свернется и выделение ДНК/РНК станет невозможным). После плавного перемешивания пробирку поместить в штатив. Гепарин в качестве антикоагулянта использовать нельзя, так как он является мощным ингибитором ПЦР.

Следует строго соблюдать температурные режимы хранения и транспортирования отобранного материала. Транспортирование осуществляют в термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом. При хранении материала более суток его необходимо заморозить при температуре минус 20°С.

2. Отбор волосяных луковиц. Для отбора волосяных луковиц поверхность кожи животного в зоне ушной раковины и волосы обрабатывают спиртом, после чего проводят аккуратное выдергивание волос. Необходимо следить, чтобы на концах взятых волос оставались волосяные луковицы, потому что именно они используются для анализа. От одного животного необходимо выдернуть 30-40 волос с луковицами. Вырванные волосы упаковывают в плотный бумажный пакет, после чего транспортируют или хранят в сухом, темном месте.

Все образцы должны иметь необходимую информацию: порода, пол, кличка, год и место рождения, идентификационный номер, а также данные о продуктивности животных в зависимости от цели исследования.

Выделение ДНК из исследуемого объекта. Самым первым и важным этапом ПЦР-ПДРФ является выделение ДНК из различного материала, которое предопределяет качество пробоподготовки и успех дальнейших исследований. От качества его исполнения зависит успех всех последующих этапов исследования. Неправильный выбор метода выделения ДНК или его неверное осуществление могут привести либо к получению загрязненной ДНК, непригодной для исследования, либо вообще к потере ДНК [302].

Выбор метода выделения ядерной ДНК определяется в зависимости от исходного материала, а также цели исследования и необходимого времени хранения выделенной ДНК. Имеется множество методов выделения нуклеиновых кислот, такие как детергентный, фенольный, фенольнодетергентный, а также сорбционные способы экстракции, которые получили широкое распространение благодаря эффективному получения препаратов ДНК приемлемой чистоты и концентрации из биоматериала [303].

Этапы выделения ДНК включают быстрый лизис клеток, удаление фрагментов клеточных органелл и мембран с помощью центрифугирования, ферментативное разрушение белков протеиназами и экстрагирование ДНК из раствора с помощью фенола и хлороформа. Затем ДНК осаждают, как правило, этанолом и после удаления надосадочной жидкости растворяют в буферном растворе [304].

Колоночное выделение ДНК. Метод колоночного выделения использует способность ДНК и РНК адгезироваться к поверхности диоксида кремния в присутствии хаотропных ионов, и легко смываться в их отсутствии. Данный метод пришел из органической химии, где на первых этапах набивались стеклянные колонки различными материалами, в том числе диоксидом кремния, потом ДНК и РНК смывались, и далее колонка разбиралась и набивалась заново. Чтобы исключить эти трудоемкие этапы, было предложено использовать одноразовые пластиковые колонки, уже с прослойкой диоксидом кремния, которые идеально подходят по размеру к обычным пробиркам Eppendorf на 1,5 и 2 мл.

Колоночный метод выделения ДНК обладает рядом преимуществ:

• Быстрота выделения (20-40 минут в зависимости от количества образцов биоматериала);

• Эффективное связывание ДНК с мембраной колонки позволяет получить наибольший выход ДНК из образца;

• Высокая степень очистки достигается благодаря оптимизированному

• составу компонентов лизирующего и промывочных растворов;

• Чистота выделенной ДНК составляет 1,8-1,9 по соотношению A260/A280;

• Выделение ДНК на колонках существенно уменьшает расход дополнительного пластика;

• Отсутствие токсичных реагентов (фенол, хлороформ и т.д.)

Одним из недостатков колоночного метода выделения ДНК является сложность получения неповрежденных длинных молекул ДНК, он рекомендуется для выделения молекул не более 50 тысяч п.н. Для анализа более крупных молекул подойдут наборы для выделения ДНК в растворе - более специализированные и сложные в использовании комплекты реагентов.

Для выделения ДНК колоночным методом можно использовать коммерческий набор PureLink Genomic DNA Mini Kit (рисунок 6). Набор позволяет выделять геномную ДНК из крови, тканей, клеток, слюны, бактерий, мазков и пятен крови, формалин-фиксированных парафиновых тканей.