-
Добавить в каждую пробирку, кроме пробирки с отрицательным контролем, по 2 мкл матричной ДНК.
-
Поместить пробирки в амплификатор и запустить соответствующий режим, который должен соответствовать праймерам, используемым в реакции. Режим амплификации:
1 94°С – 5 мин;
-
95°С – 60 с;
-
59°С – 50 с;
-
72°С – 50 с;
-
Стадии 2–4 повторяются 30 раз.
-
72°С – 5 мин.
-
Если образцы не анализируются сразу после окончания амплификации, их следует поместить в холодильник на –20°С.
Рестрикционный анализ гена бета-лактоглобулина ( βLG )
Необходимые реактивы: амплификат, рестриктазы PvuII и PstI, 10х рестрикционный буфер, бидистиллированная вода, 6×DNA Loading Dye (краситель – 6×MassRuler™, раствор с красителями для нанесения образцов на гель), раствор бромистого 10 мг/мл этидия, маркер молекулярных масс 50 п.н. DNA Ladder (Fermentas), агароза, 10×ТБЕ буфер
Необходимое оборудование и материалы: ПЦР-бокс, вортекс, камера для электрофореза, заливочный столик с гребенками, микроволновая печь или плитка, источник тока, трансиллюминатор для агарозно-этидиевых гелей, холодильник с морозильной камерой на –20°С, амплификатор, дозаторы с переменным объемом (0,1–10 мкл, 1–10 мкл, 10–100 мкл, 100–1 000 мкл), наконечники для дозаторов (0,1–10 мкл, 1–10 мкл, 10–100 мкл, 100–1 000 мкл), мерный стакан (100 мл – 1 шт., 1000 мл – 1 шт.), пробирки типа «Eppendorf» объемом 1,5 мл, микропробирки пластиковые с плоской крышкой типа «Eppendorf» объемом 0,2 или 0,5 мл соответственно амплификатору, штативы для микропробирок, лента лабораторная «Parafilm M», спирт для обработки столешницы и инструментов, емкости для отходов.
Ход работы:
-
Для идентификации аллелей гена бета-лактоглобулина продукты ПЦР разделяли на две аликвоты и обрабатывали рестрикционными энзимами PvuII и PstI.
-
В реакционную смесь общим объемом 20 мкл вносят 2 мкл 10х буфера для рестриктазы PvuII (PstI), 1 мкл фермента PvuII (PstI), 8 мкл амплификата. Объем смеси доводят бидистилированной водой до 20 мкл.
-
Полученную смесь перемешать на вортексе и инкубировать в термостате в течение 8 часов при 37°С. Все операции проводить на лабораторном столе,
фременты либо поместить в лед, либо кратковременно извлекать из морозильной камеры.
-
Приготовить 2%-ный агарозный гель для проведения электрофореза.
-
Нанести на гель рестрикцированные образцы, маркер молекулярных масс. Продукты рестрикции разделить в готовом агарозном геле в течение 2-х часов при напряжении 40 В.
-
Рассмотреть гель с помощью трансиллюминатора в УФ-свете.
Рестриктаза PvuII позволяет выявить варианты А, В и D гена беталактоглобулина, а рестриктаза PstI – вариант С. Наличие двух специфических фрагментов рестрикции по PvuII длиной 774 и 474 п.н. соответствует аллелю А. Точковая мутация в нуклеотидной последовательности варианта В обуславливает образование дополнительного сайта рестрикции PvuII и приводит к образованию трех специфических для аллеля В фрагментов длиной 774, 297 и 177 п.н. Результатом нуклеотидной замены в аллеле D гена беталактоглобулина является образование еще одного специфического для PvuII сайта, и как следствие, - появление четырех рестрикционных фрагментов длиной 563, 297, 211 и 177 п.н.
Рестрикция с использованием эндонуклеазы PstI позволяет диагностировать аллель С гена бета-лактоглобулина. В нуклеотидной последовательности варианта С имеется лишь один общий для всех аллелей сайт узнавания PstI, в то время как в вариантах А, В и D присутствует дополнительный рестрикционный сайт для эндонуклеазы PstI. При гидролизе по PstI последовательности варианта С в геле визуализируются два фрагмента длиной 182 п.н. и 1066 п.н., в то время как при гидролизе аллелей А, В и D помимо общего фрагмента длиной 179 п.н. образуются два специфических фрагмента длиной 896 и 170 п.н. (рисунок 13)
На рисунке 14 приведена схема ПЦР анализа гена бета-лактоглобулина крупного рогатого скота с указанием длин образующихся фрагментов в зависимости от генотипа животных [53].
