Контрольные вопросы

1. Составьте реакционную смесь по гену бета-лактоглобулина ( βLG ), которая готовится в объеме 20 мкл и содержит 2мкл 10х буфера, – 2 мкл MgCL2, – 2 мкл дНТФ (dNTP’s), 1 мкл каждого праймера, 0,4 мкл Taqполимеразы, 2 мкл геномной ДНК.

2. Проведите постановку ПЦР, используя программу: горячий старт – 5 мин при 94°С; 30 циклов: денатурация – 1 минута при 95°С; отжиг – 50 секунд при 59°С; синтез – 50 секунд при 72°С; достройка – 5 мин при 72°С.

3. Проведите визуализацию амплификата по гену бета-лактоглобулина ( βLG ) методом горизонтального электрофореза. Детекция результатов амплификации по гену бета-лактоглобулина: 8 мкл продукта амплификации + 0,5 мкл бромфенол голубого, раскапать в 1,5% агарозный гель (V=110, 30-35 мин.).

4. Проведите рестрикцию амплифицированного участка гена βLG . Для рестрикции амплифицированного участка гена βLG используют эндонуклеазы PvuII и PstI. Реакцию проводят при температуре 37 °С. Продукты рестрикции гена разделяют электрофоретически в 2 % агарозном геле в ТВЕ буфере с использованием бромистого этидия при напряжении 40 В в течение двух часов.

5. Какие фрагменты гена βLG образовались после рестрикции?

3.4 Проведение ПЦР-ПДРФ для генов соматотропинового каскада

Мясное скотоводство является перспективной отраслью животноводства и важным резервом увеличения производства высококачественного мяса говядины. Для успешного его развития необходимо проводить углублённую селекционную работу с учётом современных достижений генетики. При этом следует иметь в виду, что оценка животных по генетическим маркерам является более эффективной, если в неё включены гены одного физиологического пути, так как в таком случае экспрессия одного гена влияет на экспрессию всех остальных.

Большой интерес для повышения мясной продуктивности крупного рогатого скота представляют гены соматотропинового каскада, белковые продукты которых являются ключевыми звеньями одной гуморальной цепи, участвующей как в процессе лактации, так и в процессах роста и развития млекопитающих (bPit-1, bGH, bGHR, bIGF-1) Следовательно, изучение полиморфизмов этих генов является перспективным с точки зрения поиска маркеров, ассоциированных с признаками и молочной, и мясной продуктивности у крупного рогатого скота [101-103].

3.4.1 Постановка ПЦР-ПДРФ гена гипофизарного фактора транскрипции-1 ( bPit-1 )

Проведение амплификации гена гипофизарного фактора транскрипции-1 ( bPit-1 )

Необходимые реактивы: пробы ДНК, 10х ПЦР-буфер, деоионизированная вода, хлорид магния, Taq-полимераза, дезоксинуклеозидтрифосфаты (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), праймеры для исследуемого участков гена гипофизарного фактора транскрипции-1 ( bPit-1 ).

Необходимое оборудование и материалы: ПЦР-бокс, вортекс, холодильник с морозильной камерой на –20°С, амплификатор, дозаторы с переменным объемом (0,1–10 мкл, 1–10 мкл, 10–100 мкл, 100–1 000 мкл), наконечники для дозаторов (0,1–10 мкл, 1–10 мкл, 10–100 мкл, 100–1 000 мкл), пробирки типа «Eppendorf» объемом 1,5 мл, микропробирки пластиковые с плоской крышкой типа «Eppendorf» объемом 0,2 или 0,5 мл соответственно амплификатору, штативы для микропробирок, спирт для обработки столешницы и инструментов, емкости для отходов.

Ход работы:

1. Для установления генотипов крупного рогатого скота по локусу гипофизарного фактора транскрипции-1 используют следующие праймеры StuI-F: 5′-caaatggtccttttcttgttcag-3′;

StuI-R: 5′-ctttaaactcatggcaaatttc-3′ [165];

HinFI-F: 5′-aaaccatcatctcccttctt-3′;

HinFI-R: 5′-aatgtacaatgtcttctgag-3′ [120].

1. Приготовить реакционную смесь для проведения ПЦР. Смесь без ДНК матрицы приготовить в одной пробирке и затем аликвотировать по индивидуальным.

На 1 реакцию понадобится 20 мкл реакционной смеси. Необходимо взять:

– 0.3 мкл смеси dNTP;

• 2 мкл 10х ПЦР-буфера;

• 1,5 мкл прямого и 1,5 мкл обратного праймеров;

• 2 мкл хлорида магния;

• 0,4 мкл Taq-полимеразы;

• 11,2 мкл деионизованной воды.

Перемешать все компоненты. Taq-полимеразу добавить в последнюю

очередь, вынув ее из морозильной камеры холодильника и поместив на лед.

1. Полученную реакционную смесь раскапать в подготовленные пробирки. 4. Добавить в каждую пробирку, кроме пробирки с отрицательным контролем, по 1,5 мкл матричной ДНК.

2. Поместить пробирки в амплификатор и запустить соответствующий режим, который должен соответствовать праймерам, используемым в реакции.

Режим амплификации:

1 95°С – 5 мин;

1. 95°С – 45 с;

2. 55°С – 45 с;

3. 72°С – 45 с;

4. Стадии 2–4 повторяются 34 раза;

5. 72°С – 10 мин.

6. Если образцы не анализируются сразу после окончания амплификации, их следует поместить в холодильник на –20°С.

Рестрикционный анализ гена гипофизарного фактора транскрипции-1 ( bPit-1 )

Необходимые реактивы: амплификат, рестриктазы StuI и HinFI, 10х рестрикционный буфер, бидистиллированная вода, 6×DNA Loading Dye (краситель – 6×MassRuler™, раствор с красителями для нанесения образцов на гель), раствор бромистого 10 мг/мл этидия, маркер молекулярных масс TrackIt™ 50 bp DNA Ladder, агароза, 10×ТБЕ буфер

Необходимое оборудование и материалы: ПЦР-бокс, вортекс, камера для электрофореза, заливочный столик с гребенками, микроволновая печь или плитка, источник тока, трансиллюминатор для агарозно-этидиевых гелей, холодильник с морозильной камерой на –20°С, амплификатор, дозаторы с переменным объемом (0,1–10 мкл, 1–10 мкл, 10–100 мкл, 100–1 000 мкл), наконечники для дозаторов (0,1–10 мкл, 1–10 мкл, 10–100 мкл, 100–1 000 мкл), мерный стакан (100 мл – 1 шт., 1000 мл – 1 шт.), пробирки типа «Eppendorf» объемом 1,5 мл, микропробирки пластиковые с плоской крышкой типа «Eppendorf» объемом 0,2 или 0,5 мл соответственно амплификатору, штативы для микропробирок, лента лабораторная «Parafilm M», спирт для обработки столешницы и инструментов, емкости для отходов.

Ход работы:

1. Для идентификации аллелей гена гипофизарного фактора транскрипции1 продукты ПЦР разделяли на две аликвоты и обрабатывали эндонуклеазами рестрикции StuI и HinFI.

2. В реакционную смесь общим объемом 15 мкл вносят 1 мкл 10х буфера для рестриктазы StuI (HinFI), 0,5 мкл фермента StuI (HinFI), 5 мкл амплификата. Объем смеси доводят бидистилированной водой до 15 мкл.

3. Полученную смесь перемешать на вортексе и инкубировать в термостате в течение 16 часов при 37°С. Все операции проводить на лабораторном столе, фременты либо поместить в лед, либо кратковременно извлекать из морозильной камеры.

4. Приготовить 2%-ный агарозный гель для проведения электрофореза.

88