1. Нанести на гель рестрикцированные образцы, маркер молекулярных масс. Продукты рестрикции разделить в агарозном геле в течение 30 минут при напряжении 150 В.

2. Рассмотреть гель с помощью трансиллюминатора в УФ-свете.

Исследование полиморфизма нуклеотидной последовательности гена bPit - 1 в третьем экзоне, обусловленного трансверсией С→А, вызывающей замену аминокислоты пролин на гистидин в белковой последовательности, проводился с помощью рестриктазы StuI . Сайтом узнавания для рестриктазы StuI является последовательность AGG↓CCT. В ходе ферментации разрезается фрагмент, содержащий нуклеотид C, соответствующий аллелю bPit - 1 -StuI^С [151]. В случае присутствия А нуклеотида сайт рестрикции исчезает, а такой аллель обозначен как аллель bPit - 1 -StuI^А . Длина амплификата гена bPit - 1 в третьем экзоне составляет 234 п.н. Длина фрагментов после рестрикции составляет 197 и 37 п.н. На электрофореграмме видны варианты полос определенной длины, характерные для две полосы 197 и 37 п.н. (генотип bPit - 1 -StuI^СС ), три полосы 234, 197, 37 п.н. (генотип bPit - 1 -StuI^АС ). Фрагмент рестрикции 37 п.н. на агарозном геле не визуализируется (рисунок 15).

Дорожка 1 – ПЦР-продукт 234 п.н. фрагмента гена bPit - 1 -StuI;

Дорожка 2 – маркер молекулярных масс O’Range Ruler^TM 50 bp DNA Ladder, Fermentas, Литва;

Дорожки 3 – 9, 11, 12 – фрагмент рестрикции 197 п.н., соответствующий генотипу bPit - 1 -StuI^CC ; дорожка 10 – фрагменты рестрикции 234 и 197 п.н., соответствующие генотипу bPit - 1 -StuI^АC ;

Дорожка 13 – фрагмент рестрикции 234 п.н., соответствующие генотипу bPit - 1 -StuI^АА . Фрагмент рестрикции 37 п.н. не визуализируется. Положение на геле специфических полос показано стрелками.

Рисунок 15 — Электрофореграмма ДНК-типирования полиморфизма bPit - 1 -StuI.

Анализ полиморфизма нуклеотидной последовательности гена bPit - 1 в шестом экзоне проводился с помощью рестриктазы HinFI. Полиморфизм обусловлен A→G нуклеотидной заменой, не приводящей к изменению аминокислотной последовательности. Сайтом узнавания для рестриктазы HinFI является последовательность G↓ANTC. Разрезаемый в ходе ферментации фрагмент содержит нуклеотид А соответствующий аллелю bPit - 1 -HinFI^В . В случае присутствия G нуклеотида сайт рестрикции исчезает, такой аллель обозначен как bPit - 1 -HinFI^A .

Длина амплифицируемого фрагмента гена bPit - 1 составляет 451 п.н. Длина фрагментов после рестрикции составляет 244 и 207 п.н. На электрофореграмме визуализируются варианты полос определенной длины, характерные для генотипов: одна полоса 451 п.н. (генотип bPit - 1 -HinFI^АА ); две полосы 244 и 207 п.н. (генотип bPit - 1 -HinFI^ВB ); три полосы – 451, 244 и 207 п.н. (генотип bPit - 1 -HinFI^AВ ) (рисунок 16).

Дорожка 1 – маркер молекулярных масс O’Range Ruler^TM 50 bp DNA Ladder, Fermentas, Литва;

Дорожка 2 – ПЦР-продукт 451п.н. фрагмента гена bPit - 1 -HinFI;

Дорожка 3, 6 – фрагмент рестрикции 244, 207 п.н., соответствующий генотипу bPit - 1 -HinFI^BB ;

Дорожки 4,7 – фрагменты рестрикции 451, 244, 207 п.н., соответствующие генотипу bPit - 1 -HinfI^AB ;

Дорожка 5 – фрагмент рестрикции 451 п.н., соответствующий генотипу bPit - 1 -HinFI^AA . Положение на геле специфических полос показано стрелками.

Рисунок 16 - Электрофореграмма ДНК-типирования полиморфизма bPit - 1 -HinFI

Контрольные вопросы

1. Перечислите компоненты реакционной смеси, необходимые для проведения полимеразной цепной реакции: а) Taq-полимераза; б) калия хлорид; в) ДНК; г) праймеры; д) магния хлорид; е) дезоксирибонуклеозидтрифосфаты; ж) хлороформ.

2. Составьте реакционную смесь по гену гипофизарного фактора транскрипции-1 ( bPit-1 , полиморфизм bPit-1- StuI), которая готовится в объеме 20 мкл и содержит 2мкл 10х буфера, – 2 мкл MgCL2, – 0,3 мкл дНТФ (dNTP’s), 1,5 мкл каждого праймера, 0,4 мкл Taq-полимеразы, 1,5 мкл геномной ДНК.

3. Проведите постановку ПЦР, используя программу: горячий старт – 5 мин при 95°С; 34 цикла: денатурация – 45 секунд при 95°С; отжиг – 45 секунд при 55°С; синтез –45 секунд при 72°С; достройка – 10 мин при 72°С.

4. Проведите визуализацию амплификата по гену гипофизарного фактора транскрипции-1 методом горизонтального электрофореза. Детекция результатов амплификации по гену гипофизарного фактора транскрипции-1: 8 мкл продукта амплификации + 0,5 мкл бромфенол голубого, раскапать в 1,5% агарозный гель (V=110, 30-35 мин.).

5. Проведите рестрикцию амплифицированного участка гена гипофизарного фактора транскрипции-1 ( bPit-1 , полиморфизм bPit-1- StuI). Для рестрикции амплифицированного участка гена bPit-1 используют эндонуклеазу StuI. Реакцию проводят при температуре 37°С. Продукты рестрикции генов разделяют электрофоретически в 2% агарозном геле (при напряжении 150 В) 30 мин в ТВЕ буфере при УФ-свете с использованием бромистого этидия на системе гель-документирования.

3.4.2 Постановка ПЦР-ПДРФ гена гормона роста ( bGH )

Проведение амплификации гена гормона роста ( bGH )

Необходимые реактивы: пробы ДНК, 10х ПЦР-буфер, деоионизированная вода, хлорид магния, Taq-полимераза, дезоксинуклеозидтрифосфаты (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), праймеры для исследуемого участков гена bGH.

Необходимое оборудование и материалы: ПЦР-бокс, вортекс, холодильник с морозильной камерой на –20°С, амплификатор, дозаторы с переменным объемом (0,1–10 мкл, 1–10 мкл, 10–100 мкл, 100–1 000 мкл), наконечники для дозаторов (0,1–10 мкл, 1–10 мкл, 10–100 мкл, 100–1 000 мкл), пробирки типа «Eppendorf» объемом 1,5 мл, микропробирки пластиковые с плоской крышкой типа «Eppendorf» объемом 0,2 или 0,5 мл соответственно амплификатору, штативы для микропробирок, спирт для обработки столешницы и инструментов, емкости для отходов.