Ход работы:

1. Для установления генотипов крупного рогатого скота по локусу гормона

роста используют следующие праймеры

AluI –F: 5′-ccgtgtctatgagaagc-3′;

AluI-R: 5′'-gttcttgagcagcgcgt-3′ [204].

1. Приготовить реакционную смесь для проведения ПЦР. Смесь без ДНК матрицы приготовить в одной пробирке и затем аликвотировать по индивидуальным.

На 1 реакцию понадобится 10 мкл реакционной смеси. Необходимо взять:

– 2 мкл смеси dNTP;

• 1 мкл 10х ПЦР-буфера;

• 0,5 мкл прямого и 0,5 мкл обратного праймеров;

• 0,6 мкл хлорида магния;

• 0,3 мкл Taq-полимеразы;

• 4,1 мкл деионизованной воды.

Перемешать все компоненты. Taq-полимеразу добавить в последнюю

очередь, вынув ее из морозильной камеры холодильника и поместив на лед.

1. Полученную реакционную смесь раскапать в подготовленные пробирки.

2. Добавить в каждую пробирку, кроме пробирки с отрицательным контролем, по 1,5 мкл матричной ДНК.

3. Поместить пробирки в амплификатор и запустить соответствующий режим, который должен соответствовать праймерам, используемым в реакции. Режим амплификации:

4. 1 95°С – 5 мин;

5. 95°С – 15 с;

6. 55°С – 10 с;

7. 72°С – 10 с;

8. Стадии 2–4 повторяются 34 раза;

9. 72°С – 5 мин.

10. Если образцы не анализируются сразу после окончания амплификации, их следует поместить в холодильник на –20°С.

Рестрикционный анализ гена гормона роста ( bGH )

Необходимые реактивы: амплификат, рестриктаза AluI, 10х рестрикционный буфер, бидистиллированная вода, 6×DNA Loading Dye (краситель – 6×MassRuler™, раствор с красителями для нанесения образцов на гель), раствор бромистого 10 мг/мл этидия, маркера молекулярных масс TrackIt™ 50 bp DNA Ladder, агароза, 10×ТБЕ буфер

Необходимое оборудование и материалы: ПЦР-бокс, вортекс, камера для электрофореза, заливочный столик с гребенками, микроволновая печь или

плитка, источник тока, трансиллюминатор для агарозно-этидиевых гелей, холодильник с морозильной камерой на –20°С, амплификатор, дозаторы с переменным объемом (0,1–10 мкл, 1–10 мкл, 10–100 мкл, 100–1 000 мкл), наконечники для дозаторов (0,1–10 мкл, 1–10 мкл, 10–100 мкл, 100–1 000 мкл), мерный стакан (100 мл – 1 шт., 1000 мл – 1 шт.), пробирки типа «Eppendorf» объемом 1,5 мл, микропробирки пластиковые с плоской крышкой типа «Eppendorf» объемом 0,2 или 0,5 мл соответственно амплификатору, штативы для микропробирок, лента лабораторная «Parafilm M», спирт для обработки столешницы и инструментов, емкости для отходов.

Ход работы:

1. В реакционную смесь общим объемом 15 мкл вносят 1 мкл рестриктазного буфера (10x), 0,5 мкл рестриктазы AluI, 5 мкл ПЦР-продукта. Объем смеси доводят бидистилированной водой до 15 мкл.

2. Полученную смесь перемешать на вортексе и инкубировать в термостате в течение 16 часов при 37°С. Все операции проводить на лабораторном столе, ферменты либо поместить в лед, либо кратковременно извлекать из морозильной камеры.

3. Приготовить 2%-ный агарозный гель для проведения электрофореза.

4. Нанести на гель рестрикцированные образцы, маркер молекулярных масс. Продукты рестрикции разделить в готовом агарозном геле в течение 30 минут при напряжении 150 В.

5. Рассмотреть гель с помощью трансиллюминатора в УФ-свете.

Анализ полиморфизма нуклеотидной последовательности гена bGH в пятом экзоне проводится с помощью рестриктазы AluI . Полиморфизм обусловлен транзицией C→G, приводящей к замене аминокислоты лейцин на валин в последовательности белка. Сайтом узнавания для рестриктазы AluI является последовательность АG↓CТ. Распознаваемый ферментом аллель содержит нуклеотид С и обозначен как bGH -AluI^L [131]. В случае присутствия G нуклеотида сайт рестрикции исчезает, такой аллель обозначен как bGH -AluI^V (рисунок 17).

Дорожка 1 – маркер молекулярных масс O’Range Ruler^TM 50 bp DNA Ladder, Fermentas, Литва;

Дорожки 2, 6 – фрагменты рестрикции 208, 172, 35 п.н., соответствующие генотипу bGH -AluI^LV ;

Дорожки 3, 4 ,7 – фрагмент рестрикции 172 п.н., соответствующий генотипу bGH -AluI^LL ;

Дорожка 5 – фрагмент рестрикции 208 п.н., соответствующий генотипу bGH -AluI^VV ;

Дорожка 9 – ПЦР-продукт 208 п.н. фрагмента гена bGH -AluI. Фрагмент рестрикции 35 п.н. не визуализируется. Положение на геле специфических полос показано стрелками.

Рисунок 17 — Электрофореграмма ДНК-типирования полиморфизма bGH -AluI

Длина амплифицируемого фрагмента гена bGH составляет 208 п.н. Длина фрагментов после рестрикции составляет 172 и 35 п.н. На электрофореграмме могут быть видны варианты полос определенной длины, характерные для генотипов: одна полоса 208 п.н. (генотип bGH -AluI^VV ); две полосы 172 и 35 п.н. (генотип bGH -AluI^LL ); три полосы 208, 172 и 35 п.н. (генотип bGH -AluI^LV ). Фрагмент рестрикции 35 п.н. на агарозном геле не визуализируется.

Контрольные вопросы

1. Этапы амплификации: а) денатурация; б) элонгация; в) ренатурация; г) отжиг.

2. Составьте реакционную смесь по гену гормона роста (bGH) , которая готовится в объеме 10 мкл и содержит 1 мкл 10х буфера, – 0,6 мкл MgCL2, 2 мкл дНТФ (dNTP’s), 0,5 мкл каждого праймера, 0,3 мкл Taq-полимеразы, 1,5 мкл геномной ДНК.