Анализ полиморфизма нуклеотидной последовательности гена bPit - 1 в шестом экзоне проводился с помощью рестриктазы HinFI. Полиморфизм обусловлен A→G нуклеотидной заменой, не приводящей к изменению аминокислотной последовательности. Сайтом узнавания для рестриктазы HinFI является последовательность G↓ANTC. Разрезаемый в ходе ферментации фрагмент содержит нуклеотид А соответствующий аллелю bPit - 1 -HinFI^В . В случае присутствия G нуклеотида сайт рестрикции исчезает, такой аллель обозначен как bPit - 1 -HinFI^A .

Длина амплифицируемого фрагмента гена bPit - 1 составляет 451 п.н. Длина фрагментов после рестрикции составляет 244 и 207 п.н. На электрофореграмме визуализируются варианты полос определенной длины, характерные для генотипов: одна полоса 451 п.н. (генотип bPit - 1 -HinFI^АА ); две полосы 244 и 207 п.н. (генотип bPit - 1 -HinFI^ВB ); три полосы – 451, 244 и 207 п.н. (генотип bPit - 1 -HinFI^AВ ) (рисунок 16).

Дорожка 1 – маркер молекулярных масс O’Range Ruler^TM 50 bp DNA Ladder, Fermentas, Литва;

Дорожка 2 – ПЦР-продукт 451п.н. фрагмента гена bPit - 1 -HinFI;

Дорожка 3, 6 – фрагмент рестрикции 244, 207 п.н., соответствующий генотипу bPit - 1 -HinFI^BB ;

Дорожки 4,7 – фрагменты рестрикции 451, 244, 207 п.н., соответствующие генотипу bPit - 1 -HinfI^AB ;

Дорожка 5 – фрагмент рестрикции 451 п.н., соответствующий генотипу bPit - 1 -HinFI^AA . Положение на геле специфических полос показано стрелками.

Рисунок 16 - Электрофореграмма ДНК-типирования полиморфизма bPit - 1 -HinFI

Контрольные вопросы

1. Перечислите компоненты реакционной смеси, необходимые для проведения полимеразной цепной реакции: а) Taq-полимераза; б) калия хлорид; в) ДНК; г) праймеры; д) магния хлорид; е) дезоксирибонуклеозидтрифосфаты; ж) хлороформ.

2. Составьте реакционную смесь по гену гипофизарного фактора транскрипции-1 ( bPit-1 , полиморфизм bPit-1- StuI), которая готовится в объеме 20 мкл и содержит 2мкл 10х буфера, – 2 мкл MgCL2, – 0,3 мкл дНТФ (dNTP’s), 1,5 мкл каждого праймера, 0,4 мкл Taq-полимеразы, 1,5 мкл геномной ДНК.

3. Проведите постановку ПЦР, используя программу: горячий старт – 5 мин при 95°С; 34 цикла: денатурация – 45 секунд при 95°С; отжиг – 45 секунд при 55°С; синтез –45 секунд при 72°С; достройка – 10 мин при 72°С.

4. Проведите визуализацию амплификата по гену гипофизарного фактора транскрипции-1 методом горизонтального электрофореза. Детекция результатов амплификации по гену гипофизарного фактора транскрипции-1: 8 мкл продукта амплификации + 0,5 мкл бромфенол голубого, раскапать в 1,5% агарозный гель (V=110, 30-35 мин.).

5. Проведите рестрикцию амплифицированного участка гена гипофизарного фактора транскрипции-1 ( bPit-1 , полиморфизм bPit-1- StuI). Для рестрикции амплифицированного участка гена bPit-1 используют эндонуклеазу StuI. Реакцию проводят при температуре 37°С. Продукты рестрикции генов разделяют электрофоретически в 2% агарозном геле (при напряжении 150 В) 30 мин в ТВЕ буфере при УФ-свете с использованием бромистого этидия на системе гель-документирования.

3.4.2 Постановка ПЦР-ПДРФ гена гормона роста ( bGH )

Проведение амплификации гена гормона роста ( bGH )

Необходимые реактивы: пробы ДНК, 10х ПЦР-буфер, деоионизированная вода, хлорид магния, Taq-полимераза, дезоксинуклеозидтрифосфаты (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), праймеры для исследуемого участков гена bGH.

Необходимое оборудование и материалы: ПЦР-бокс, вортекс, холодильник с морозильной камерой на –20°С, амплификатор, дозаторы с переменным объемом (0,1–10 мкл, 1–10 мкл, 10–100 мкл, 100–1 000 мкл), наконечники для дозаторов (0,1–10 мкл, 1–10 мкл, 10–100 мкл, 100–1 000 мкл), пробирки типа «Eppendorf» объемом 1,5 мл, микропробирки пластиковые с плоской крышкой типа «Eppendorf» объемом 0,2 или 0,5 мл соответственно амплификатору, штативы для микропробирок, спирт для обработки столешницы и инструментов, емкости для отходов.

Ход работы:

1. Для установления генотипов крупного рогатого скота по локусу гормона

роста используют следующие праймеры

AluI –F: 5′-ccgtgtctatgagaagc-3′;

AluI-R: 5′'-gttcttgagcagcgcgt-3′ [204].

1. Приготовить реакционную смесь для проведения ПЦР. Смесь без ДНК матрицы приготовить в одной пробирке и затем аликвотировать по индивидуальным.

На 1 реакцию понадобится 10 мкл реакционной смеси. Необходимо взять:

– 2 мкл смеси dNTP;

• 1 мкл 10х ПЦР-буфера;

• 0,5 мкл прямого и 0,5 мкл обратного праймеров;

• 0,6 мкл хлорида магния;

• 0,3 мкл Taq-полимеразы;

• 4,1 мкл деионизованной воды.

Перемешать все компоненты. Taq-полимеразу добавить в последнюю

очередь, вынув ее из морозильной камеры холодильника и поместив на лед.

1. Полученную реакционную смесь раскапать в подготовленные пробирки.

2. Добавить в каждую пробирку, кроме пробирки с отрицательным контролем, по 1,5 мкл матричной ДНК.

3. Поместить пробирки в амплификатор и запустить соответствующий режим, который должен соответствовать праймерам, используемым в реакции. Режим амплификации:

4. 1 95°С – 5 мин;

5. 95°С – 15 с;

6. 55°С – 10 с;

7. 72°С – 10 с;

8. Стадии 2–4 повторяются 34 раза;

9. 72°С – 5 мин.

10. Если образцы не анализируются сразу после окончания амплификации, их следует поместить в холодильник на –20°С.

Рестрикционный анализ гена гормона роста ( bGH )

Необходимые реактивы: амплификат, рестриктаза AluI, 10х рестрикционный буфер, бидистиллированная вода, 6×DNA Loading Dye (краситель – 6×MassRuler™, раствор с красителями для нанесения образцов на гель), раствор бромистого 10 мг/мл этидия, маркера молекулярных масс TrackIt™ 50 bp DNA Ladder, агароза, 10×ТБЕ буфер

Необходимое оборудование и материалы: ПЦР-бокс, вортекс, камера для электрофореза, заливочный столик с гребенками, микроволновая печь или