плитка, источник тока, трансиллюминатор для агарозно-этидиевых гелей, холодильник с морозильной камерой на –20°С, амплификатор, дозаторы с переменным объемом (0,1–10 мкл, 1–10 мкл, 10–100 мкл, 100–1 000 мкл), наконечники для дозаторов (0,1–10 мкл, 1–10 мкл, 10–100 мкл, 100–1 000 мкл), мерный стакан (100 мл – 1 шт., 1000 мл – 1 шт.), пробирки типа «Eppendorf» объемом 1,5 мл, микропробирки пластиковые с плоской крышкой типа «Eppendorf» объемом 0,2 или 0,5 мл соответственно амплификатору, штативы для микропробирок, лента лабораторная «Parafilm M», спирт для обработки столешницы и инструментов, емкости для отходов.

Ход работы:

1. В реакционную смесь общим объемом 15 мкл вносят 1 мкл рестриктазного буфера (10x), 0,5 мкл рестриктазы AluI, 5 мкл ПЦР-продукта. Объем смеси доводят бидистилированной водой до 15 мкл.

2. Полученную смесь перемешать на вортексе и инкубировать в термостате в течение 16 часов при 37°С. Все операции проводить на лабораторном столе, ферменты либо поместить в лед, либо кратковременно извлекать из морозильной камеры.

3. Приготовить 2%-ный агарозный гель для проведения электрофореза.

4. Нанести на гель рестрикцированные образцы, маркер молекулярных масс. Продукты рестрикции разделить в готовом агарозном геле в течение 30 минут при напряжении 150 В.

5. Рассмотреть гель с помощью трансиллюминатора в УФ-свете.

Анализ полиморфизма нуклеотидной последовательности гена bGH в пятом экзоне проводится с помощью рестриктазы AluI . Полиморфизм обусловлен транзицией C→G, приводящей к замене аминокислоты лейцин на валин в последовательности белка. Сайтом узнавания для рестриктазы AluI является последовательность АG↓CТ. Распознаваемый ферментом аллель содержит нуклеотид С и обозначен как bGH -AluI^L [131]. В случае присутствия G нуклеотида сайт рестрикции исчезает, такой аллель обозначен как bGH -AluI^V (рисунок 17).

Дорожка 1 – маркер молекулярных масс O’Range Ruler^TM 50 bp DNA Ladder, Fermentas, Литва;

Дорожки 2, 6 – фрагменты рестрикции 208, 172, 35 п.н., соответствующие генотипу bGH -AluI^LV ;

Дорожки 3, 4 ,7 – фрагмент рестрикции 172 п.н., соответствующий генотипу bGH -AluI^LL ;

Дорожка 5 – фрагмент рестрикции 208 п.н., соответствующий генотипу bGH -AluI^VV ;

Дорожка 9 – ПЦР-продукт 208 п.н. фрагмента гена bGH -AluI. Фрагмент рестрикции 35 п.н. не визуализируется. Положение на геле специфических полос показано стрелками.

Рисунок 17 — Электрофореграмма ДНК-типирования полиморфизма bGH -AluI

Длина амплифицируемого фрагмента гена bGH составляет 208 п.н. Длина фрагментов после рестрикции составляет 172 и 35 п.н. На электрофореграмме могут быть видны варианты полос определенной длины, характерные для генотипов: одна полоса 208 п.н. (генотип bGH -AluI^VV ); две полосы 172 и 35 п.н. (генотип bGH -AluI^LL ); три полосы 208, 172 и 35 п.н. (генотип bGH -AluI^LV ). Фрагмент рестрикции 35 п.н. на агарозном геле не визуализируется.

Контрольные вопросы

1. Этапы амплификации: а) денатурация; б) элонгация; в) ренатурация; г) отжиг.

2. Составьте реакционную смесь по гену гормона роста (bGH) , которая готовится в объеме 10 мкл и содержит 1 мкл 10х буфера, – 0,6 мкл MgCL2, 2 мкл дНТФ (dNTP’s), 0,5 мкл каждого праймера, 0,3 мкл Taq-полимеразы, 1,5 мкл геномной ДНК.

1. Проведите постановку ПЦР, используя программу: горячий старт – 5 мин при 95°С; 34 цикла: денатурация – 15 секунд при 95°С; отжиг –10 секунд при 55°С; синтез – 10 секунд при 72°С; достройка – 5 минут при 72°С.

2. Проведите визуализацию амплификата по гену гормона роста методом горизонтального электрофореза. Детекция результатов амплификации по гену гормона роста: 5 мкл продукта амплификации + 0,5 мкл бромфенол голубого, раскапать в 1,5% агарозный гель (V=110, 30-35 мин.).

3. Проведите рестрикцию амплифицированного участка гена гормона роста. Для рестрикции амплифицированного участка гена bGH используют эндонуклеазу AluI. Реакцию проводят при температуре 37°С. Продукты рестрикции генов разделяют электрофоретически в 2% агарозном геле (при напряжении 150 В) 30 мин в ТВЕ буфере при УФ-свете с использованием бромистого этидия на системе гель-документирования.

3.4.3 Постановка ПЦР-ПДРФ гена рецептора гормона роста ( bGHR ) Проведение амплификации гена рецептора гормона роста ( bGHR )

Необходимые реактивы: пробы ДНК, 10х ПЦР-буфер, деоионизированная вода, хлорид магния, Taq-полимераза, дезоксинуклеозидтрифосфаты (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), праймеры для исследуемого участков гена bGHR.

Необходимое оборудование и материалы: ПЦР-бокс, вортекс, холодильник с морозильной камерой на –20°С, амплификатор, дозаторы с переменным объемом (0,1–10 мкл, 1–10 мкл, 10–100 мкл, 100–1 000 мкл), наконечники для дозаторов (0,1–10 мкл, 1–10 мкл, 10–100 мкл, 100–1 000 мкл), пробирки типа «Eppendorf» объемом 1,5 мл, микропробирки пластиковые с плоской крышкой типа «Eppendorf» объемом 0,2 или 0,5 мл соответственно амплификатору, штативы для микропробирок, спирт для обработки столешницы и инструментов, емкости для отходов.

Ход работы:

1. Для установления генотипов крупного рогатого скота по локусу гормона роста используют следующие праймеры

SspI-F: 5′-aatatgtagcagtgacaatat-3′;

SspI-R: 5′-acgtttcactgggttgatga-3′ [252].

1. Приготовить реакционную смесь для проведения ПЦР. Смесь без ДНК матрицы приготовить в одной пробирке и затем аликвотировать по индивидуальным.

На 1 реакцию понадобится 20 мкл реакционной смеси. Необходимо взять:

– 0,25 мкл смеси dNTP;

• 2 мкл 10х ПЦР-буфера;

• 1,7 мкл прямого и 1,7 мкл обратного праймеров;