• 2 мкл хлорида магния;

• 0,3 мкл Taq-полимеразы;

• 10,1 мкл деионизованной воды.

Перемешать все компоненты. Taq-полимеразу добавить в последнюю

очередь, вынув ее из морозильной камеры холодильника и поместив на лед.

1. Полученную реакционную смесь раскапать в подготовленные пробирки.

2. Добавить в каждую пробирку, кроме пробирки с отрицательным контролем, по 1,5 мкл матричной ДНК.

3. Поместить пробирки в амплификатор и запустить соответствующий

режим, который должен соответствовать праймерам, используемым в реакции. Режим амплификации:

• 1 95°С – 3 мин;

• 95°С – 30 с;

• 62°С – 30 с;

• 72°С – 30 с;

• Стадии 2–4 повторяются 30 раз;

• 72°С – 10 мин.

• Если образцы не анализируются сразу после окончания амплификации, их следует поместить в холодильник на –20°С.

Рестрикционный анализ гена рецептора гормона роста ( bGHR )

Необходимые реактивы: амплификат, рестриктаза SspI, 10х рестрикционный буфер, бидистиллированная вода, 6×DNA Loading Dye (краситель – 6×MassRuler™, раствор с красителями для нанесения образцов на гель), раствор бромистого 10 мг/мл этидия, маркера молекулярных масс TrackIt™ 50 bp DNA Ladder, агароза, 10×ТБЕ буфер

Необходимое оборудование и материалы: ПЦР-бокс, вортекс, камера для электрофореза, заливочный столик с гребенками, микроволновая печь или плитка, источник тока, трансиллюминатор для агарозно-этидиевых гелей, холодильник с морозильной камерой на –20°С, амплификатор, дозаторы с переменным объемом (0,1–10 мкл, 1–10 мкл, 10–100 мкл, 100–1 000 мкл), наконечники для дозаторов (0,1–10 мкл, 1–10 мкл, 10–100 мкл, 100–1 000 мкл), мерный стакан (100 мл – 1 шт., 1000 мл – 1 шт.), пробирки типа «Eppendorf» объемом 1,5 мл, микропробирки пластиковые с плоской крышкой типа «Eppendorf» объемом 0,2 или 0,5 мл соответственно амплификатору, штативы для микропробирок, лента лабораторная «Parafilm M», спирт для обработки столешницы и инструментов, емкости для отходов.

Ход работы:

1. В реакционную смесь общим объемом 13 мкл вносят 1,3 мкл рестриктазного буфера (10x), 0,3 мкл рестриктазы SspI, 5 мкл ПЦР-продукта. Объем смеси доводят бидистилированной водой до 13 мкл.

2. Полученную смесь перемешать на вортексе и инкубировать в термостате в течение 16 часов при 37°С. Все операции проводить на лабораторном столе, ферменты либо поместить в лед, либо кратковременно извлекать из морозильной камеры.

3. Приготовить 2%-ный агарозный гель для проведения электрофореза.

4. Нанести на гель рестрикцированные образцы, маркер молекулярных масс. Продукты рестрикции разделить в готовом агарозном геле в течение 30 минут при напряжении 150 В.

5. Рассмотреть гель с помощью трансиллюминатора в УФ-свете.

Анализ полиморфизма нуклеотидной последовательности гена bGHR в восьмом экзоне проводился с помощью рестриктазы SspI . Рестриктаза SspI распознает Т→А транзицию в восьмом экзоне. Данная SNP вызывает подстановку полярного, хотя и незаряженного остатка тирозина вместо нейтрального фенилаланина в положении -279 белка. Сайтом узнавания для рестриктазы является последовательность ААТ↓АТТ. Разрезаемый ферментом амплификат содержит нуклеотид Т соответствующий аллелю bGHR -SspI^F [226]. В случае присутствия A-нуклеотида сайт рестрикции исчезает, такой аллель обозначен как bGHR -SspI^Y . Длина амплифицируемого фрагмента гена bGHR составляет 182 п.н. Длина фрагментов после рестрикции 158 и 24 п.н. На электрофореграмме могут быть видны варианты полос определенной длины, характерные для генотипов: одна полоса 182 п.н. (генотип bGHR -SspI^YY ), две полосы 158 и 24 п.н. (генотип bGHR -SspI^FF ); три полосы – 182, 158 и 24 п.н. (генотип bGHR -SspI^FY ). Фрагмент 24 п.н. на агарозном геле не визуализируется (рисунок 18).

Дорожка 1 – ПЦР-продукт 182 п.н. фрагмента гена bGHR -SspI;

Дорожки 2, 3, 4 – фрагмент рестрикции 158 п.н., соответствующий генотипу bGHR -SspI^FF ;

Дорожка 5 – фрагмент рестрикции 182 п.н., соответствующий генотипу bGHR -SspI^YY ;

Дорожка 6 – фрагменты рестрикции 182 и 158 п.н., соответствующие генотипу bGHR -SspI^FY . Фрагмент 24 п.н. не визуализируется. Использован маркер молекулярных масс O’Range Ruler^TM 50 bp DNA Ladder, Fermentas, Литва. Положение на геле специфических полос показано стрелками.

Рисунок 18 – Электрофореграмма ДНК-типирования полиморфизма bGHR -SspI

Контрольные вопросы

1. Денатурация – это: а) процесс образования двухцепочечных молекул из одиночных полинуклеотидных комплементарных цепей; б) расхождение цепей двуцепочечной молекулы ДНК или РНК; в) нарушение нативной конформации биологических макромолекул в результате разрушения нековалентных (водородных) связей; г) удлинение нуклеотидной цепи путем добавления новых нуклеотидов.

2. Составьте реакционную смесь по гену рецептора гормона роста (bGHR) , которая готовится в объеме 20 мкл и содержит 2 мкл 10х буфера, 2 мкл MgCL2, 0,25 мкл дНТФ (dNTP’s), 1,7 мкл каждого праймера, 0,3 мкл Taq-полимеразы, 1,5 мкл геномной ДНК.

3. Проведите постановку ПЦР, используя программу: горячий старт – 3 минуты при 95°С; 30 циклов: денатурация – 30 секунд при 95°С; отжиг – 30 секунд при 62°С; синтез – 30 секунд при 72°С; достройка – 10 минут при 72°С.

4. Проведите визуализацию амплификата по гену рецептора гормона роста методом горизонтального электрофореза. Детекция результатов амплификации по гену гормона роста: 5 мкл продукта амплификации + 0,5 мкл бромфенол голубого, раскапать в 1,5% агарозный гель (V=110, 30-35 мин.).