Генетическое маркирование мясной и молочной продуктивности крупного рогатого скота

1. Проведите рестрикцию амплифицированного участка гена рецептора гормона роста. Для рестрикции амплифицированного участка гена bGH используют эндонуклеазу SspI. Реакцию проводят при температуре 37°С. Продукты рестрикции генов разделяют электрофоретически в 2% агарозном геле (при напряжении 150 В) 30 мин в ТВЕ буфере при УФ-свете с использованием бромистого этидия на системе гель-документирования.

3.4.4 Постановка ПЦР-ПДРФ гена инсулиноподобного фактора роста-1 ( bIGF-1 )

Проведение амплификации гена инсулиноподобного фактора роста-1 ( bIGF-1 )

Необходимые реактивы: пробы ДНК, 10х ПЦР-буфер, деоионизированная вода, хлорид магния, Taq-полимераза, дезоксинуклеозидтрифосфаты (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), праймеры для исследуемого участков гена bIGF-1.

Необходимое оборудование и материалы: ПЦР-бокс, вортекс, холодильник с морозильной камерой на –20°С, амплификатор, дозаторы с переменным объемом (0,1–10 мкл, 1–10 мкл, 10–100 мкл, 100–1 000 мкл), наконечники для дозаторов (0,1–10 мкл, 1–10 мкл, 10–100 мкл, 100–1 000 мкл), пробирки типа «Eppendorf» объемом 1,5 мл, микропробирки пластиковые с плоской крышкой типа «Eppendorf» объемом 0,2 или 0,5 мл соответственно амплификатору, штативы для микропробирок, спирт для обработки столешницы и инструментов, емкости для отходов.

Ход работы:

1. Для установления генотипов крупного рогатого скота по локусу гормона роста используют следующие праймеры

SnaBI-F: 5′-attcaaagctgcctgcccc-3′;

SnaBI-R: 5′-acacgtatgaaaggaact-3′ [312].

1. Приготовить реакционную смесь для проведения ПЦР. Смесь без ДНК матрицы приготовить в одной пробирке и затем аликвотировать по индивидуальным.

На 1 реакцию понадобится 20 мкл реакционной смеси. Необходимо взять: – 0,25 мкл смеси dNTP;

• 2 мкл 10х ПЦР-буфера;

– 1,7 мкл прямого и 1,7 мкл обратного праймеров;

• 2 мкл хлорида магния;

• 0,3 мкл Taq-полимеразы;

• 10,55 мкл деионизованной воды.

Перемешать все компоненты. Taq-полимеразу добавить в последнюю очередь, вынув ее из морозильной камеры холодильника и поместив на лед.

1. Полученную реакционную смесь раскапать в подготовленные пробирки.

2. Добавить в каждую пробирку, кроме пробирки с отрицательным контролем, по 1,5 мкл матричной ДНК.

3. Поместить пробирки в амплификатор и запустить соответствующий режим, который должен соответствовать праймерам, используемым в реакции. Режим амплификации:

1 95°С – 5 мин;

1. 95°С – 30 с;

2. 64°С – 30 с;

3. 72°С – 30 с;

4. Стадии 2–4 повторяются 35 раз;

5. 72°С – 10 мин;

6. Если образцы не анализируются сразу после окончания амплификации, их следует поместить в холодильник на –20°С.

Рестрикционный анализ гена инсулиноподобного фактора роста-1 ( bIGF-1 )

Необходимые реактивы: амплификат, рестриктаза SnaBI, 10х рестрикционный буфер, бидистиллированная вода, 6×DNA Loading Dye (краситель – 6×MassRuler™, раствор с красителями для нанесения образцов на гель), раствор бромистого 10 мг/мл этидия, маркера молекулярных масс TrackIt™ 50 bp DNA Ladder, агароза, 10×ТБЕ буфер

Необходимое оборудование и материалы: ПЦР-бокс, вортекс, камера для электрофореза, заливочный столик с гребенками, микроволновая печь или плитка, источник тока, трансиллюминатор для агарозно-этидиевых гелей, холодильник с морозильной камерой на –20°С, амплификатор, дозаторы с переменным объемом (0,1–10 мкл, 1–10 мкл, 10–100 мкл, 100–1 000 мкл), наконечники для дозаторов (0,1–10 мкл, 1–10 мкл, 10–100 мкл, 100–1 000 мкл), мерный стакан (100 мл – 1 шт., 1000 мл – 1 шт.), пробирки типа «Eppendorf» объемом 1,5 мл, микропробирки пластиковые с плоской крышкой типа «Eppendorf» объемом 0,2 или 0,5 мл соответственно амплификатору, штативы для микропробирок, лента лабораторная «Parafilm M», спирт для обработки столешницы и инструментов, емкости для отходов.

Ход работы:

1. В реакционную смесь общим объемом 13,2 мкл вносят 1,3 мкл рестриктазного буфера (10x), 0,3 мкл рестриктазы SspI, 5 мкл ПЦР-продукта. Объем смеси доводят бидистилированной водой до 13,2 мкл.

2. Полученную смесь перемешать на вортексе и инкубировать в термостате в течение 16 часов при 37°С. Все операции проводить на лабораторном столе,

ферменты либо поместить в лед, либо кратковременно извлекать из морозильной камеры.

1. Приготовить 2%-ный агарозный гель для проведения электрофореза.

2. Нанести на гель рестрикцированные образцы, маркер молекулярных масс. Продукты рестрикции разделить в готовом агарозном геле в течение 30 минут при напряжении 150 В.

3. Рассмотреть гель с помощью трансиллюминатора в УФ-свете.

Полиморфизм нуклеотидной последовательности гена инсулиноподобного фактора роста-1 bIGF - 1 в области Р1 промоторного региона идентифицирован как Т→С трансверсия. Эта замена распознается рестриктазой SnaBI . Амплифицируется фрагмент гена bIGF - 1 длиной 249 п.н. [304]. Длина фрагментов после рестрикции составляет 223 и 26 п.н. На электрофореграмме могут быть видны варианты полос определенной длины, характерные для генотипов: одна полоса 249 п.н. (генотип bIGF - 1 -SnaBI^ВВ ); две полосы 223 и 26 п.н. (генотип bIGF - 1 -SnaBI^АA ); три полосы 249, 223 и 26 п.н. (генотип bIGF - 1 - SnaBI^АB ). Фрагмент 26 п.н. на агарозном геле не визуализируется (рисунок 19).

Дорожка 1 – маркер молекулярных масс O’Range Ruler^TM 50 bp DNA Ladder, Fermentas, Литва;

Дорожка 2 – ПЦР-продукт 249 п.н. фрагмента гена bIGF - 1 -SnaBI; Дорожки 3, 4 – фрагменты рестрикции 249 и 223 п.н., соответствующие генотипу -SnaBI^АВ ;

Дорожки 5, 6 – фрагмент рестрикции 223 п.н., соответствующий генотипу bIGF - 1 -SnaBI^АА ;

Дорожка 7 – фрагмент рестрикции 249 п.н., соответствующий генотипу bIGF - 1 -SnaBI^ВВ . Фрагмент 26 п.н. не визуализируется. Положение на геле специфических полос показано стрелками.

Рисунок 19 – Электрофореграмма ДНК-типирования полиморфизма bIGF - 1 -SnaBI