Контрольные вопросы:

1. Из каких компонентов состоит реакционная смесь для амплификации ДНК?

2. Составьте реакционную смесь по гену инсулиноподобного фактора роста-1 ( bIGF-1 ), которая готовится в объеме 20 мкл и содержит 2 мкл 10х буфера, 2 мкл MgCL2, 0,25 мкл дНТФ (dNTP’s), 1,7 мкл каждого праймера, 0,3 мкл Taq-полимеразы, 1,5 мкл геномной ДНК.

3. Проведите постановку ПЦР, используя программу: горячий старт – 5 минут при 95°С; 35 циклов: денатурация – 30 секунд при 95°С; отжиг – 30 секунд при 64°С; синтез – 30 секунд при 72°С; достройка – 10 минут при 72°С.

4. Проведите визуализацию амплификата по гену инсулиноподобного фактора роста-1 методом горизонтального электрофореза. Детекция результатов амплификации по гену гормона роста: 5 мкл продукта амплификации + 0,5 мкл бромфенол голубого, раскапать в 1,5% агарозный гель (V=110, 30-35 мин.).

5. Проведите рестрикцию амплифицированного участка гена инсулиноподобного фактора роста-1. Для рестрикции амплифицированного участка гена bIGF-1 используют эндонуклеазу SnaBI. Реакцию проводят при температуре 37°С. Продукты рестрикции генов разделяют электрофоретически в 2% агарозном геле (при напряжении 150 В) 30 мин в ТВЕ буфере при УФсвете с использованием бромистого этидия на системе гель-документирования.

3.5 Ошибки ПЦР-ПДРФ и их предотвращение

Достоверность заключений по любому эксперименту определяется качеством полученных результатов. Ошибки проведения ПЦР-ПДРФ могут быть обусловлены различными причинами. Минимизирование ошибок возможно при оценке особенностей используемых экспериментальных методов, их оптимизации, надлежащему использованию контролей, повторностей, а также разработки статистических подходов для выявления ошибок [313].

Ошибки разделены исследователями на категории [314].

1 - обусловленные особенностями собственно последовательности молекулы ДНК.

2 - низкое качество и/или недостаточное количество ДНК. Как низкое качество, так и малое количество ДНК обуславливают «выпадение» (dropout) аллелей в гетерозиготах (амплификация только одной предпочтительно более короткой аллели). При контаминации образцов ДНК возможна амплификация контаминантных аллелей. Одним из решений проблемы в случае малого количества ДНК предложен метод разделения образца на несколько пробирок и проведение реакции амплификации в каждой из них [315].

3 - артефакты, обусловленные реагентами. Ошибки, связанные с особенностью Tag-полимеразы добавлять к 3´-концу не принадлежащий к последовательности амплифицируемого фрагмента нуклеотид (как правило, аденин). Эта реакция чувствительна к последовательности 5´-конца праймера и длительному времени элонгации в ПЦР. «Slippage» («запинание») Tagполимеразы на первых стадиях ПЦР приводит к появлению ложных аллелей. Реагенты низкого качества могут отрицательно влиять на условия ПЦР, неадекватные условия электрофореза могут приводить к искаженной картине распределения аллелей по размеру и т.д.

4 - человеческий фактор. Существенная доля ошибок ПЦР-ПДРФ обусловлена именно этим фактором [316. Так, это может быть связано с субъективностью оценки электрофореграмм и радиоавтограмм, и соответствующим некорректным обозначением аллелей, что в свою очередь зависит и от качества данных; загрязнение экзогенной ДНК или случайное перекрестное «заражение» образцов, использование неоптимальных протоколов, неоптимальных праймеров, температуры плавления в ПЦР, ошибки при вводе и обработке данных и др. [317]. На практике для выявления ошибок ПЦР-ПДРФ проводится повторная реакция амплификации и сравнение полученных продуктов первоначального и повторного анализа для определенного ряда образцов, другими словами – анализ дублированных образцов [318]

В свою очередь ошибки ПЦР-ПДРФ, возникающие при действии человеческого фактора, также условно можно разделить на три категории, соответствующие этапам анализа:

• Ошибки преаналитического этапа. Данный этап включает взятие биоматериала, его хранение и транспортировку, пробоподготовку. В первую очередь, необходимо правильно определить место взятия биологического материала для исследования. Второй распространенной ошибкой преаналитического этапа является неправильное взятие материала на исследование. При работе с кровью важно учитывать тот факт, что для предотвращения ее свертывания в процессе доставки необходимо использовать антикоагулянты. Однако, наиболее распространенный антикоагулянт – гепарин является мощным ингибитором ПЦР, поэтому его использование в данном случае недопустимо. Принципиальным для получения адекватных результатов ПЦР является хранение биологического материала. Необходимо помнить о температуре хранения биологического материала, а также сроках и способах его доставки в ПЦР-лабораторию в случае, если транспортировка требует значительного времени. При нарушении сроков хранения или транспортировки биоматериала ДНК или РНК могут разрушаться, что приведет к ложноотрицательным результатам. Образцы рекомендуется хранить при температуре от 2 до 8°С в течение 24-48 часов, для более длительного хранения необходимо замораживание.

- Ошибки аналитического этапа. Проведение собственно лабораторного исследования также может сопровождаться рядом ошибок, среди которых одной из основных является неправильный выбор системы пробоподготовки. Выбор метода выделения должен определяться характером биоматериала, степенью его загрязнения потенциальными ингибиторами ПЦР. Использование экспресс-методов существенно сокращает время пробоподготовки, делает минимальными потери ДНК в процессе выделения и существенно сокращает риск кросс-контаминации, что представляется весьма привлекательным для рутинного использования в лаборатории. Однако, существенным недостатком данной группы методов является низкая степень очистки пробы от ингибиторов, следствием чего 3-5% образцов дают недостоверные результаты в ПЦР. Сорбентные методы можно определить, как «универсальные», однако для них характерно длительное время выделения, что может привести к перекрестной контаминации; потери ДНК с сорбентом – выход ДНК напрямую зависит от качества сорбента.

• Ошибки постаналитического этапа. Основной проблемой постаналитического этапа является неверная интерпретация исследователем результатов ПЦР-ПДРФ анализа [319].

ПЦР-ПДРФ анализ связан с проблемой, обусловленной высокой чувствительностью метода, – возможностью контаминации.

Контаминация – попадание из внешней среды в реакционную смесь специфических и неспецифических молекул нуклеиновых кислот, способных служить мишенями в реакции амплификации и давать ложноположительные или ложноотрицательные результаты.

Сотрудник, занимающийся ПЦР-ПДРФ диагностикой, в своей работе сталкивается с тремя видами контаминации:

1. Перекрестная контаминация от пробы к пробе (в процессе обработки биоматериала или при раскапывании реакционной смеси), приводящая к появлению ложноположительных результатов.

2. Контаминация продуктами амплификации (ампликонами), имеющая наибольшее значение, поскольку в процессе ПЦР ампликоны накапливаются в огромных количествах и являются идеальными продуктами для реамплификации.

3. Контаминация следовыми количествами ампликонов посуды, автоматических пипеток и лабораторного оборудования, поверхностей лабораторных столов или даже поверхности кожи сотрудников лаборатории приводит к появлению систематических ложноположительных результатов.

Как правило, определить источник контаминации бывает очень трудно и требует значительных затрат времени и средств [320].

Основными правилами предотвращения контаминации в лаборатории являются:

• Разделение функциональных рабочих зон;