• Соблюдение поточности и направления движения анализируемых образцов;

• Отдельные лабораторные халаты в каждой рабочей зоне;

• Одноразовые перчатки без талька;

• Наконечники для дозаторов с фильтрами, защищающими от аэрозоля;

• Одноразовые пластиковые пробирки, посуда, наконечники;

• Химическая и УФ дезинфекция всех поверхностей рабочих зон.

Все три зоны должны быть изолированными комнатами, снабженными предбоксниками. Полезно иметь устройство фильтрации воздуха.

Кроме того, желательно предусмотреть отдельные помещения для переодевания и хранения верхней одежды, приема пищи, складское помещение для лабораторных материалов. Все производственные комнаты должны быть снабжены коротковолновыми ультрафиолетовыми лампами. Перемещение пробирок, штативов и пр. должно производиться только в направлении из «чистой» зоны в зоны пробоподготовки и детекции. Клинический материал, поступивший в лабораторию, должен быть как можно быстрее обработан в комнате пробоподготовки. В эту же комнату должны поступать пробирки с реакционной смесью из «чистой» зоны для внесения в них препаратов ДНК. После этого пробирки помещают в амплификатор и, по окончании термоциклирования, не открывая крышек, переносят в зону детекции. Все операции (пробоподготовка, подготовка реакционной смеси, электрофорез) должны выполнять разные люди [321].

Контрольные вопросы

1. На какие категории можно разделить ошибки проведения ПЦР-ПДРФ?

2. Появление ложноположительных результатов при попадании в пробирку следовых количеств положительной ДНК – это: а) кроссинговер; б) конъюгация; в) контаминация; г) корреляция

3. Основные принципы предотвращения контаминации при работе с биологическим материалом.

4. Условия хранения биологического материла.

5. Какие меры необходимо предпринять, если были выявлены ошибки

ПЦР-ПДРФ анализа?

3.6 Статистическая обработка данных для оценки эффективности маркеров

Объем производства продукции животноводства непосредственно определяется двумя показателями - численностью животных и их продуктивностью. При учете численности животных их дифференцируют по видам, породам, возрасту, полу, производственному назначению,

продуктивности и т.д. Все виды животных в первую очередь подразделяют на основное стадо (матки и самцы - производители) и молодняк.

При анализе валовой продукции животноводства рассматривают продукцию нормальной жизнедеятельности животных, связанной с хозяйственным использованием животных как средство производства (молоко), а также продукцию выращивания скота (мясная продукция), использование которой для потребления человеком предполагает забой животных. Продуктивность представляют собой выход продукции на 1 голову животных. При оценке молочной продуктивности существенное значение имеет учет качества молока (калорийность, содержание сухих веществ, жира, белка, молочного сахара). Источниками статистических данных о численности и продуктивности скота являются годовые, месячные и квартальные отчеты; отчеты о состоянии животноводства.

Статистическую обработку результатов ПЦР-ПДРФ и данных зоотехнического и племенного учета проводят методами популяционногенетического и биометрического анализа (П.Ф. Рокицкий, 1961; Н.А. Плохинский, 1970; Е.К. Меркурьева, 1977) [322].

Исследование генетической структуры крупного рогатого скота включает сравнение выборок по распределению частот аллельных вариантов генов соматотропинового каскада, а также оценку соответствия распределения частот генотипов теоретически ожидаемому в соответствии с законом ХардиВайнберга.

Частоты генотипов определяются методом прямого подсчета Относительную частоту аллелей рассчитывают по формуле (2):

p=(2nAA+nAB)/2N и q=(2nBB+nAB)/2N (2)

где p – частота аллеля A , q – частота аллеля B , nAA , nAB , nBB – число особей с данным генотипом, N – общее число особей [323].

Статистическую ошибку относительных частот аллелей вычисляют по формуле (2):

SQ=√(Q(1- Q)/2n) (2)

где Q − относительная частота исследуемого аллеля; n − объем выборки [324].

Cравнение выборок по распределению частот аллельных вариантов исследуемых генов проводят с помощью критерия χ² , формула (3). Число степеней свободы =1:

χ 2 =∑(Но-Не)/Не (3)

где Но − наблюдаемые частоты аллелей;

106

Не − ожидаемые частоты аллелей [324].

В случае, если ожидаемые значения численности хотя бы в одном из классов оказывается меньше пяти, то расчет χ² осуществлялся с поправкой Йетса, формула (4):

χ² =∑((Но-Не)-0,5)² / Не (4)

Соответствие фактического распределения генотипов теоретически ожидаемому в соответствии с законом Харди-Вайнберга оценивается с помощью критерия χ² , формула (5). Число степеней свободы равняется одному (число генотипов минус число аллелей).

χ² =∑(Но-Не)² / Не (5) где Но − наблюдаемые частоты генотипов,

Не − ожидаемые частоты генотипов: (6) АА=p² ; AB=2pq; BB=q² [324].

В случае, если ожидаемые значения численности хотя бы в одном из классов оказывается меньше пяти, то расчет χ² осуществляется с поправкой Йетса:

χ² =∑((Но-Не)-0,5)² / Не (7)

Допустимое значение χ² для одной степени свободы и 5% уровня значимости составляет 3,84 [324].

Для оценки влияния генотипов на признаки продуктивности вначале необходимо выявить предпочтительный и альтернативный генотипы. Для полиморфизмов, у которых группы животных с разными генотипами достоверно различаются между собой по конкретному признаку, генотип, характеризующийся наиболее высоким уровнем продуктивности, является предпочтительным, а два других – нежелательными при отборе животных в ходе селекционного процесса.

Предпочтительный и нежелательные генотипы для каждого полиморфизма определяют путем сравнения средних значений показателей продуктивности в группах животных с разными генотипами между собой, с достоверностью разницы - * P<0,05; ** P<0,01.

Достоверность различий сравниваемых показателей оценивают по критерию Стьюдента.