натной температуры переносят в мерную колбу на 100 мл и доливают до метки дистиллированной водой.
- Стандартный раствор глюкозы (концентрация 50 мг%): 50 мг глюкозы, высушенной в сушильном шкафу до постоянной массы при температуре 100°С, растворяют в 100 мл 0,2%-ного раствора бензойной кислоты. Бензойная кислота увеличивает стабильность стандартного раствора глюкозы. Хранят раствор в холодильнике.
Специальное оборудование и аппаратура. ФЭК, сушильный шкаф, колбареторта, песочная баня, колбы мерные на 100 мл, лабораторный автотрансформатор, центрифуга, водяная баня, пробирки химические, пробирки центрифужные, термометр лабораторный на 150°С, штативы для пробирок, холодильник бытовой, термос на 3–5 л.
Материал для исследования. Материалом служит безбелковый фильтрат крови, полученный путем смешивания и последующего центрифугирования равных объемов 20%-ного раствора трихлоруксусной кислоты и цельной крови.
Ход определения. В пробирку вносят 0,2 мл безбелкового фильтрата крови, 0,3 мл дистиллированной воды и 4,5 мл ортотолуидинового реактива. Пробирку помещают в кипящую водяную баню (вода должна постоянно кипеть) ровно на 8 мин, после чего сразу охлаждают до комнатной температуры под водопроводной водой. Фотометрируют против контроля при длине волны 590– 655 нм (оранжевый или красный светофильтр) в кювете толщиной 10 мм. В контрольную пробирку вносят 0,1 мл 20%-ного раствора ТХУ и 0,4 мл дистиллированной воды и 4,5 мл ортотолуидинового реактива.
Стандартная проба. Стандартные пробы ставят как опытные, но вместо безбелкового фильтрата берут 0,1 мл глюкозы с концентрацией 50 мг%, 0,1 мл 20%-ного раствора ТХУ, 0,3 мл дистиллированной воды и 4,5 мл ортотолуидинового реактива.
Расчеты результатов. Проводят их по формуле
Con = Ccm EEcm on ,
где Соп — концентрация глюкозы в пробе, мг%; Сст — концентрация глюкозы в стандарте, мг%; Еоп — оптическая плотность пробы; Ест — оптическая плотность стандарта.
Ошибка метода составляет ±2,5%.
4.2.2. Определение глюкозы в безбелковом фильтрате крови по методу Сомоджи
Принцип метода. Метод основан на окислении глюкозы в щелочной среде при кипячении с сернокислой медью. При йодометрическом определении образовавшаяся закись меди окисляется йодом. Последний освобождается подкислением определенного количества йодноватокислого калия и йодистого калия, а оставшийся свободный йод оттитровывается гипосульфитом.
Реактивы.
- 5%-ный раствор сернокислого цинка: 5 г сернокислого цинка 7-водного (ZnSO4 × 7H2O) растворяют в 95 мл дистиллированной воды.
- 0,3 н. раствор NaOH: 12 г NaOH ч. д. а., х. ч. растворяют в 700 мл дистиллированной воды, охлаждают и водой доводят объем в мерной колбе до 1 л.
Для растворов 1 и 2 не так важна абсолютная концентрация, как то, чтобы они нейтрализовали друг друга объем в объем. Последнее проверяется медленным титрованием с индикатором фенолфталеином.
-
Реактив Сомоджи, в 1 л которого содержится:
-
а) медь сернокислая, 5-водная, (CuSO4 × 5H2O) ч. д. а., х. ч. — 8 г;
-
б) натрий углекислый (NaCO3) безводный, ч. д. а., х. ч. — 30 г;
-
в) калий-натрий виннокислый, 4-водный (сегнетова соль) (KNaC4H4O6 ×
× 4H2O), ч. д. а. — 30 г;
-
г) калий йодистый (KI), ч. д. а., х. ч. — 5 г;
-
д) натрий сернокислый безводный (Na2SO4), ч. д. а., х. ч. — 180 г;
-
е) 1 н. раствор едкого натрия (NaOH), х. ч. — 40 мл (готовят из фиксанала);
ж) калий йодноватистокислый 1 н. раствор, ч. д. а., х. ч. (35,67 г KIO3 растворяют в 1 л дистиллированной воды) — 5 мл.
Приготовление раствора Сомоджи.
Натрий углекислый и калий-натрий виннокислый растворяют в 200 мл горячей дистиллированной воды, добавляют раствор NaOH, перемешивают, после чего раствор кипятят для удаления СО2.
Натрий сернокислый растворяют в 500 мл горячей дистиллированной воды и нагревают до кипения. Оба раствора смешивают и добавляют калий йодистый, предварительно растворенный в малом количестве дистиллированной воды. Затем вливают раствор йодноватистокислого калия и после охлаждения доливают дистиллированной водой в мерной колбе до 1 л.
Через несколько дней раствор фильтруют (обычно через 2 дня). Реактив рекомендуется хранить при комнатной температуре, не подвергая его действию солнечного света. Если температура ниже 20°С, выпадают кристаллы натрия сернокислого, то перед употреблением реактив необходимо немного подогреть и растворить осадок. При высоких концентрациях сахара в крови (у мелких животных при сахарной нагрузке) можно использовать более разведенный фильтрат.
-
2 н. раствор серной кислоты: берут 56 мл концентрированной серной кислоты (плотность 1,84) и доводят объем дистиллированной водой в мерной колбе до 1 л.
-
0,005 н. раствор натрия серноватокислого 5-водного (гипосульфита натрия, Na2S2O3), ч. д. а. (готовят перед анализом из 0,1 н. раствора, приготовленного из фиксанала).
-
1%-ный раствор крахмала, приготовленный в насыщенном растворе хлористого натрия.
Чтобы приготовить насыщенный раствор NaCl, необходимо при кипячении дистиллированной воды добавлять к ней при перемешивании NaCl до тех пор, пока не образуется осадок, т. е. избыток NaCl останется нерастворенным. После чего к этому раствору добавляют необходимое количество растворимого крахмала.
Например, в колбе объемом 250 мл, заполненной на 2/3 дистиллированной водой, растворяют 35 г NaCl (х. ч., ч. д. а.), нагревают до кипения и добавляют при перемешивании NaCl до тех пор, пока не образуется осадок. Затем раствор охлаждают и надосадочную жидкость переливают в мерную колбу на 100 мл более чем до ее половины. Выливают в ту же колбу 1 г растворимого крахмала (х. ч., ч. д. а.), предварительно растворенного в пробирке в нескольких миллилитрах дистиллированной воды при кипячении в течение 3–5 мин до полного просветления. После этого колбу доливают до метки раствором хлористого натрия. Перемешивают. Приготовленный в насыщенном растворе поваренной соли крахмал сохраняется намного дольше.
- 1%-ный спиртовой раствор фенолфталеина.
Готовят следующим образом: 0,1 г индикатора фенолфталеина растворяют в 100 мл 96°-ного этилового спирта.
Специальное оборудование и аппаратура . Пробирки 2,0–2,5 × 15 см, водяная баня, микробюретка на 5 мл, мерные колбы на 1000 мл, колбы из термостойкого стекла на 500 и 1000 мл, холодильник бытовой, термос на 3–5 л, центрифуга, штативы для пробирок, пробирки химические.
Материал для исследования. Материалом служит стабилизированная гепарином кровь.
Осаждение белков. Одна часть крови гемолизируется в 5 частях дистиллированной воды и смешивается с 0,3 н. раствора NaOH из расчета: два объема щелочи на один объем крови. Затем добавляют 2 объема 5%-ного раствора сернокислого цинка. Тщательно перемешивают и через 30 мин фильтруют или центрифугируют при 1500 об/мин в течение 10 мин. Фильтрат сливают в другую пробирку. Кровь, таким образом, будет разбавлена 1:10. Изменяя соотношение воды и крови, можно получить безбелковый фильтрат меньшей концентрации.
При хранении крови концентрация глюкозы снижается, поэтому осаждение белка необходимо производить сразу после взятия крови. Кровь необходимо по возможности быстрее доставлять в термосе со льдом в лабораторию, где получают безбелковый фильтрат, который может храниться в холодильнике не более 5 дней.
Ход определения. В пробирку для анализа берут 5 мл прозрачного безбелкового фильтрата крови и 5 мл реактива Сомоджи, тщательно перемешивают и помещают на 15 мин в кипящую баню. Охлаждают до комнатной температуры. После охлаждения содержимое пробирки подкисляют 2,5–3,0 мл 2 н. серной кислоты. Чтобы подкисление пробы произошло одновременно, рекомендуется добавлять кислоту, быстро встряхивая пробирку. Затем в пробирку вносят 2– 3 капли 1%-ного раствора крахмала, перемешивают. Титруют из микробюретки 0,005 н. раствором гипосульфита до исчезновения синей окраски.
Контроль делают как опыт, но вместо фильтрата крови используют 5 мл воды.
Расчеты результатов. Расчет результатов ведут по формуле Х = ( А – В ) × 30,
