Кетоз коров и телят

Приготовление рабочих растворов для построения калибровочного графика

Берут по 0,01 мл каждого разведения калибровочного раствора и выполняют те же операции, что и с опытными пробами (обязательно выдерживают в водяной бане точно так же, как и пробирки с исследуемой сывороткой). В противном случае цветная реакция с фосфор-ванилиновым реактивом не наступает или будет очень слабой, нехарактерной. Холостую пробу с дистиллированной водой можно не выдерживать в водяной бане.

На основании полученных данных строят калибровочный график.

Прямолинейная зависимость между концентрацией общих липидов и оптической плотностью сохраняется до 1200 мг%. Поэтому при большей концентрации сыворотку крови разводят физраствором и результаты умножают на разведение.

Для определения этим методом содержания общих липидов в тканях животных необходимо свежую или замороженную ткань подвергнуть десмолизу в 33%-ном растворе калия гидроксида. В пробирку помещают 200 или 300 мг ткани, прибавляют 3 мл 33%-ного калия гидроксида и выдерживают на кипящей водяной бане 60–120 мин, периодически встряхивая. Содержимое пробирок доводят дистиллированной водой до 5 мл и тщательно перемешивают. Из этого содержимого берут 0,2 мл в другую пробирку, приливают 1 мл серной кислоты и кипятят в бане или выдерживают в термостате при температуре 130°С в течение 20 мин. После охлаждения приливают 2 мл фосфорванилинового реактива и дальнейшие операции проводят так же, как описано выше с сывороткой крови. Однако в этом случае при исследовании на ФЭКе удобнее пользоваться кюветами с толщиной слоя 0,5 см.

Общие липиды — обобщенное понятие, включающие НЭЖК, триглицериды, фосфолипиды, свободный и эстерифицированный холестерин, сфингомиелины.

Физиологическая концентрация в сыворотке крови составляет 140– 550 мг%. Патологические изменения содержания липидов в крови происходят в основном в виде увеличения концентрации — гиперлипидемии, касаясь одного или группы липидов.

4.5.3. Определение содержания фосфолипидов (по Бартлетту – Ушеру)

Принцип. Метод основан на минерализации липидов с помощью хлорной кислоты. Неорганический фосфор, взаимодействуя с аммония молибдатом, об-

разует фосфомолибденовую кислоту, которую восстанавливают эйконогеном и натрия пиросульфитом в молибденовую синь. По степени окраски, определяемой колориметрически, вычисляют количество неорганического фосфора, содержащегося в фосфолипидах. Фосфолипиды стабильны в сыворотке или в плазме крови в течение 1 дня при комнатной температуре, 1 недели при хранении в холодильнике.

Реактивы.

1. Экстракционная смесь Фолча (хлороформ-метанол, 2:1).

2. 72%-ная хлорная кислота (НСIO ~~4~~ ) или смесь равных объемов 60%-ной хлорной и 95–97%-ной серной кислот (плотность 1,84).

3. 5%-ный раствор аммония молибдата [(NН4)6 × Мо7O24 × Н2О] (по объ-

ему).

1. Сульфит-сульфоновый реактив. 13 г пиросульфита натрия (Na2S2O5), 0,5 г сульфита натрия (Na2SO3) и 0,25 г эйконогена (1-амино-2-нафтол-4сульфоновая кислота) растворяют в 100 мл дистиллированной воды (перегнанной в стеклянном дистилляторе) при постоянном встряхивании в течение 1 ч. Фильтруют через бумажный фильтр (лучше через синтетический № 4) и хранят в темной склянке. Реактив готовят еженедельно.

Оборудование: ФЭК или спектрофотометр; песчаная баня; водяная баня; колбочки плоскодонные на 50 и 100 мл; воронки; пробирки с притертыми пробками и делениями на 10 мл; пипетки.

Ход определения. Для анализа берут 0,5 мл сыворотки крови, 0,5 г гомогената тканей или 0,2–0,4 г желтка и экстрагируют по методу Фолча. В две параллельные пробирки вносят экстракт липидов в объеме, соответствующем 0,1 мл сыворотки крови, 0,02 г тканей или 0,01 г яичного желтка, добавляют по 0,6 мл хлорной кислоты и ставят на песчаную баню для сжигания при 180^о С.

После просветления содержимого (через 1–1,5 ч) пробирки охлаждают и, тщательно перемешивая, последовательно добавляют следующие реактивы: по 4 мл дистиллированной воды, по 0,2 мл сульфит-сульфонового реактива и по 0,2 мл раствора аммония молибдата. Затем пробирки закрывают и помещают в водяную баню при 100°С на 10 мин. После охлаждения колориметрируют при длине волны 660 или 830 нм в кюветах с толщиной слоя 0,5–1 см против контрольной пробы (без липидов).

Расчет ведут по калибровочному графику, для построения которого используют двузамещенный фосфорнокислый калий (К2НРО4), высушенный до постоянной массы. 2,194 г реактива растворяют в 500 мл бидистиллированной воды. 1 мл раствора содержит 1 мг фосфора. Из основного раствора готовят рабочий раствор путем 50-кратного разведения водой (в 1 мл содержится 20 мкг фосфора). Если определение оптической плотности проводят на ФЭКе, то калибровочный график строят в пределах от 0,2 до 20 мкг, если же на спектрофотометре, то от 5 до 60 мкг фосфора (табл. 4.2).

Из каждого разведения берут по 2 мл калибровочного раствора, вносят в 2–3 параллельные пробирки и далее проделывают все операции, как описано выше. На основании полученных данных строят калибровочный график.

Приготовление растворов для построения калибровочного графика

Содержание общих фосфолипидов обычно выражают через количество содержащихся в них фосфатов — в ммоль/1 л, содержание отдельных фракций — также через содержание фосфатов или в процентах по отношению к сумме фосфора всех фосфолипидов.

Пересчет фосфора в фосфолипидах путем умножения на 25 нельзя признать правильным, так как это соответствует только для фосфотидилхолинов (лецитинов), в молекуле которых содержится 4% фосфора. В других подклассах фосфолипидов доля фосфора иная.

Клиническое значение. Фосфолипиды поступают в кровь главным образом из печени, поэтому их уровень тесно связан с функциональным состоянием данного органа. Концентрация общих фосфолипидов в норме составляет у крупного рогатого скота 170–250 мг/100 мл, у свиней — 90–200 мг/100 мл. Повышение концентрации фосфолипидов в сыворотке крови отмечается при стеотозе (жировой дегенерации) печени, тяжелой форме сахарного диабета, нефрозе и нефрите, постгеморрагической анемии. Снижение уровня фосфолипидов — частый признак острого и хронического гепатита различной этиологии; оно отмечается также при неполноценном кормлении, особенно белкововитаминной недостаточности, при дисбалансе аминокислот в рационе, алиментарной дистрофии, анемиях.

4.5.4. Определение содержания триацилглицеринов (по Сардесаю и Маннингу)

Принцип. Метод представляет собой модификацию метода Ван-Ханделя и Зильверсмита (1957) для прямого определения триацилглицеринов. Глицерол, освобожденный омылением, окисляется до формальдегида, концентрация последнего определяется колориметрически с применением реакции Hantzsch. Данный метод позволяет выявить триацилглицерины во всех биологических субстратах — сыворотке крови, печени, мышцах, жировой ткани и др.

Кровь с гепарином или с ЭДТА может храниться в вакуумной пробирке в течение 8 ч. Пробы не замораживают.

Реактивы.

1. Экстрагирующая смесь (хлороформ-метанол 2:1 или спирт-эфир 3:1).

2. Кремниевая кислота (силикагель), активированная при 105°С в течение 10–12 ч.