Кетоз коров и телят

Ход определения. К 2 мл реактива 1 добавляют 0,1 мл негемолизированной сыворотки, встряхивают короткими энергичными движениями и помещают в термостат на 20 мин при 37°С. Окрашенную в зеленый цвет жидкость колориметрируют на спектрофотометре (длина волны 650–660 нм) или на ФЭКе (красный светофильтр) в кюветах диаметром 0,5 см против контрольной пробы на реактивы (вместо сыворотки вносят 0,1 мл воды).

Расчет ведут по предварительно составленному калибровочному графику. Рабочий раствор холестерина готовят разведением стандартного в 10 раз (10 мл стандартного раствора + 90 мл хлороформа). 1 мл рабочего раствора содержит 0,1 мг холестерина. Затем в пробирки вносят по 0,1; 0,25; 0,50; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 и 3 мл рабочего раствора, что соответствует 0,025; 0,05; 0,10; 0,20; 0,25 и 0,30 мг холестерина. В седьмую пробирку вносят 1 мл хлороформа. Пробирки помещают в водяную баню для выпаривания досуха хлороформа; добавляют в них по 2 мл реактива 1 и далее поступают так как описано выше.

При постановке реакции используют абсолютно чистые и совершенно сухие пипетки и пробирки. Соотношение ингредиентов реактива рассчитано так, что белки сыворотки не выпадают в осадок. Появление мути может быть вызвано только наличием воды в реактиве или посуде.

При исследовании холестерина в экстракте липидов его вносят в пробирку в объеме, содержащем не более 1–5 мг чистых липидов.

Клиническое значение. Холестерин в сыворотке крови животных находится в двух формах: свободной (1/3) и эфирносвязанной с различными жирными кислотами (2/3). С возрастом концентрация холестерина возрастает. Гиперхолестеринемия отмечается при диабете, нефрозах, пониженной функции щитовидной железы; в начале голодания; у свиней и птицы — при скармливании рационов, обогащенных твердыми кормовыми жирами. При острых гепатитах уровень общего холестерина в начале заболевания обычно повышается, а затем падает ниже нормы. Для заболевания печени характерно падение эфирной фракции холестерина. Острое падение этой фракции в крови — плохой прогностический признак, указывающий на острую желтую атрофию печени или ее острое отравление.

4.5.7. Определение содержания этерифицированного холестерина в сыворотке крови (по Балаховскому)

Принцип. Метод основан на связывании свободного холестерина дигитонином (благодаря чему образуется нерастворимое в хлороформе соединение) и растворении хлороформом эфирносвязанного холестерина. Хлороформенный экстракт, содержащий эфирносвязанный холестерин, используется для цветной реакции с реактивом Илька (или с другим специфическим реактивом).

Реактивы.

1. Экстрагирующая смесь (ЭС: хлороформ-метанол 2:1 или этанол-эфир 3:1).

2. 1%-ный спиртовой раствор дигитонина. 1 г дигитонина растворяют в 50 мл этилового спирта и доводят до 100 мл дистиллированной водой с подогревом.

1. Смесь ледяной уксусной кислоты, уксусного ангидрида и концентрированной серной кислоты (1:5:1). Готовят, как описано выше (см. определение содержания общего холестерина в сыворотке крови).

Оборудование: центрифужные пробирки; пробирки с притертыми пробками на 10 мл; пипетки на 0,1, 1 и 5 мл; штатив для пробирок; водяная баня; центрифуга; ФЭК или спектрофотометр.

Ход определения. 0,1 мл сыворотки (плазмы) крови вносят в центрифужную пробирку, содержащую 5 мл ЭС, тщательно перемешивают стеклянной палочкой и оставляют стоять на 5–10 мин при использовании хлороформметаноловой смеси или на 1 ч при использовании спиртово-эфирной смеси. Затем центрифугируют в течение 10–15 мин при 2000–3000 об/мин. Центрифугат осторожно сливают в пробирку с притертой пробкой и ставят в водяную баню для выпаривания (не досуха, оставляют 0,5–1 мл центрифугата). Прибавляют 1 мл раствора дигитонина и перемешивают. Образуется белый налет — комплекс свободного холестерина с дигитонином. Оставляют стоять на 2–3 ч (или на ночь), после чего выпаривают досуха. После охлаждения в пробирку добавляют 5 мл хлороформа, тщательно взбалтывают. Хлороформенный экстракт фильтруют через обезжиренный бумажный фильтр или сливают после центрифугирования и используют для цветной реакции. С этой целью экстракт упаривают до минимума, добавляют 2 мл реактива 3, ставят в темное место на 20 мин, после чего колориметрируют. Хлороформ извлекает эфир холестерина, но не растворяет ни дигитонин-холестериновый комплекс, ни избыточный дигитонин.

Расчет ведут по калибровочной прямой, составленной для общего холестерина (см. определение содержания общего холестерина в сыворотке крови). По разности между общим и связанным находят количество свободного холестерина.

Клиническое значение. В норме доля эфирносвязанного холестерина в сыворотке крови животных достигает 70–90, у птиц — 60–70%. В результате все изменения его содержания отражают главным образом состояние печени и поджелудочной железы, где синтезируется эта фракция. Снижение данной фракции часто является следствием поражения синтетической функции печени и (или) поджелудочной железы.

4.5.8. Определение содержания β -липопротеидов в сыворотке (плазме) крови (по Бурштейну в модификации Виноградовой)

Липопротеиды (ЛП) сыворотки крови играют важную роль в жизнедеятельности организма. Они обеспечивают транспорт липидов как экзогенного (кормового) происхождения, так и синтезированных в печени и стенке тонкого кишечника (т. е. эндогенного происхождения) в систему циркуляции и далее к местам утилизации или депонирования; входят в состав клеточных мембран и ферментов; обезвреживают токсины; влияют на функцию свертывания крови и т. д.

Важнейшей физиологической функцией отдельных ЛП (α-ЛП) является удаление избытка свободного холестерина из клеток периферических тканей и обратный транспорт их в печень, где он окисляется в желчные кислоты и с желчью через кишечник выводится из организма. Наконец, ЛП осуществляет транспорт жирорастворимых витаминов, в том числе обладающих антиоксидантной активностью (α- и γ-токоферол, α- и β -каротин, убихинон и др.), а также стероидные гормоны и другие БАВ.

ЛП представляют собой водорастворимые комплексы, состоящие из липидной — холестерина (ХС), триацилглицерина (ТГ), фосфолипидной (ФЛ) и белковой части — аполипопротеида (АПО). Соотношение белок/липид может колебаться в широких пределах. И чем больше размер ЛП, тем больше в ней липидная часть, значит, меньше относительная плотность и меньше подвижность при электрофорезе.

Структура ЛП-комплекса, его липидный состав и обмен во многом определяются природой АПО, который активирует или тормозит соответствующие ферменты.

На основе неодинаковой относительной плотности при центрифугировании в растворах разной плотности или подвижности при электрофорезе в сыворотке крови млекопитающих различают четыре класса ЛП (табл. 4.4): хиломикроны (ХМ) — самый крупный по величине и самый легкий по относительной плотности класс. При центрифугировании флотирует по поверхности (d < < 1,006), второй класс — ЛП очень низкой плотности (ЛПОНП, d = 1,006– 1,019) или пре- β -ЛП. Затем идут ЛП низкой плотности (ЛПНП, d = 1,006–1,063) или β -ЛП и ЛП высокой плотности (ЛПВП, d = 1,063–1,21), или α-ЛП.

При электрофорезе ХМ остаются на старте, подобно γ-глобулинам, ЛПОНП, ЛПНП и ЛПВП занимают положение β , α1- и α2-глобулинов соответственно. У птиц в сыворотке крови содержится только три класса ЛП, ХМ у них не обнаружены. Как видно из таблицы 4.4, ХМ и ЛПОНП переносят в крови преимущественно ТГ, ЛПОНП — ХС и ЭХ, ЛПВП — ФЛ и ХЭ.

Таблица 4.4

Состав и свойства липопротеидов

С изменением физиологического состояния организма животных меняется и роль отдельных классов ЛП в обмене липидов. Так, отмечено повышение концентрации ЛПОНП в сыворотке крови высокопродуктивных и жирномолочных коров, а у кур — в период пика яйцекладки.