Кетоз коров и телят

Для получения плазмы кровь в пробирках с антикоагулянтом (№ 1) осторожно перемешивают, наливают в центрифужные пробирки и центрифугируют 20–30 мин при 2000–3000 об/мин. Плазму переносят в другие пробирки и хранят в холодильнике.

В плазме крови определяют содержание натрия, калия, каротина, витаминов А и С.

В цельной крови из пробирки № 1 определяют гематокрит, кетоновые тела, медь, цинк, кобальт, марганец.

Кровь в пробирке № 3 с вазелиновым маслом центрифугируют 20–30 мин при 2000–3000 об/мин. В плазме определяют содержание СО2 (щелочной резерв).

Смесь крови и ТХУ в пробирке № 4 центрифугируют в течение 20– 30 мин при 2000–3000 об/мин. Верхний слой (безбелковый фильтрат) сливают в другую пробирку и в ней определяют глюкозу, неорганический фосфор и неорганический магний. Безбелковый фильтрат крови хранят в холодильнике не более 5 дней.

4.2. Методы определения глюкозы в крови

4.2.1. Определение глюкозы в безбелковом фильтрате крови

по цветной реакции с ортотолуидином

Принцип метода. Глюкоза при нагревании с ортотолуидином в растворе уксусной кислоты образует соединение, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации глюкозы.

Реактивы.

1) Ортотолуидин ч. желтого цвета; 2) ледяная уксусная кислота, х. ч.; 3) тиомочевина, ч. д. а.; 4) ТХУ, ч. д. а., х. ч.; 5) бензойная кислота, ч. д. а., х. ч.; 6) глюкоза, ч. д. а.;

Подготовка реактивов .

1. Ортотолуидин ч. желтого цвета, обязательно подлежит перегонке в колбе-реторте при 200°С (на песочной бане); свежеприготовленный ортотолуидин должен быть бесцветным или слабо-желтого цвета. Экстинкция при 590– 655 нм против воды не должна превышать 0,02. Реактив стоек при хранении в посуде из темного стекла, без доступа воздуха.

Ортотолуидиновый реактив: в колбу на 100 мл вносят 94 мл ледяной уксусной кислоты и растворяют в ней 0,15 г тиомочевины, затем добавляют 6 мл ортотолуидина (подвергнутого перегонке). Полученный реактив стоек при хранении в холодильнике.

1. 20%-ный раствор ТХУ: берут 20 г ТХУ, помещают в мерную колбу объемом 100 мл и добавляют дистиллированной воды до метки, тщательно перемешивают.

2. 0,2%-ный раствор бензойной кислоты: 0,2 г кристаллической бензойной кислоты разводят в небольшом количестве воды (например, в пробирке), нагревают в водяной бане до полного растворения. После охлаждения до ком-

натной температуры переносят в мерную колбу на 100 мл и доливают до метки дистиллированной водой.

1. Стандартный раствор глюкозы (концентрация 50 мг%): 50 мг глюкозы, высушенной в сушильном шкафу до постоянной массы при температуре 100°С, растворяют в 100 мл 0,2%-ного раствора бензойной кислоты. Бензойная кислота увеличивает стабильность стандартного раствора глюкозы. Хранят раствор в холодильнике.

Специальное оборудование и аппаратура. ФЭК, сушильный шкаф, колбареторта, песочная баня, колбы мерные на 100 мл, лабораторный автотрансформатор, центрифуга, водяная баня, пробирки химические, пробирки центрифужные, термометр лабораторный на 150°С, штативы для пробирок, холодильник бытовой, термос на 3–5 л.

Материал для исследования. Материалом служит безбелковый фильтрат крови, полученный путем смешивания и последующего центрифугирования равных объемов 20%-ного раствора трихлоруксусной кислоты и цельной крови.

Ход определения. В пробирку вносят 0,2 мл безбелкового фильтрата крови, 0,3 мл дистиллированной воды и 4,5 мл ортотолуидинового реактива. Пробирку помещают в кипящую водяную баню (вода должна постоянно кипеть) ровно на 8 мин, после чего сразу охлаждают до комнатной температуры под водопроводной водой. Фотометрируют против контроля при длине волны 590– 655 нм (оранжевый или красный светофильтр) в кювете толщиной 10 мм. В контрольную пробирку вносят 0,1 мл 20%-ного раствора ТХУ и 0,4 мл дистиллированной воды и 4,5 мл ортотолуидинового реактива.

Стандартная проба. Стандартные пробы ставят как опытные, но вместо безбелкового фильтрата берут 0,1 мл глюкозы с концентрацией 50 мг%, 0,1 мл 20%-ного раствора ТХУ, 0,3 мл дистиллированной воды и 4,5 мл ортотолуидинового реактива.

Расчеты результатов. Проводят их по формуле

Con = Ccm EEcm on ,

где Соп — концентрация глюкозы в пробе, мг%; Сст — концентрация глюкозы в стандарте, мг%; Еоп — оптическая плотность пробы; Ест — оптическая плотность стандарта.

Ошибка метода составляет ±2,5%.

4.2.2. Определение глюкозы в безбелковом фильтрате крови по методу Сомоджи

Принцип метода. Метод основан на окислении глюкозы в щелочной среде при кипячении с сернокислой медью. При йодометрическом определении образовавшаяся закись меди окисляется йодом. Последний освобождается подкислением определенного количества йодноватокислого калия и йодистого калия, а оставшийся свободный йод оттитровывается гипосульфитом.

Реактивы.

1. 5%-ный раствор сернокислого цинка: 5 г сернокислого цинка 7-водного (ZnSO4 × 7H2O) растворяют в 95 мл дистиллированной воды.

1. 0,3 н. раствор NaOH: 12 г NaOH ч. д. а., х. ч. растворяют в 700 мл дистиллированной воды, охлаждают и водой доводят объем в мерной колбе до 1 л.

Для растворов 1 и 2 не так важна абсолютная концентрация, как то, чтобы они нейтрализовали друг друга объем в объем. Последнее проверяется медленным титрованием с индикатором фенолфталеином.

1. Реактив Сомоджи, в 1 л которого содержится:

2. а) медь сернокислая, 5-водная, (CuSO4 × 5H2O) ч. д. а., х. ч. — 8 г;

3. б) натрий углекислый (NaCO3) безводный, ч. д. а., х. ч. — 30 г;

4. в) калий-натрий виннокислый, 4-водный (сегнетова соль) (KNaC4H4O6 ×

× 4H2O), ч. д. а. — 30 г;

• г) калий йодистый (KI), ч. д. а., х. ч. — 5 г;

• д) натрий сернокислый безводный (Na2SO4), ч. д. а., х. ч. — 180 г;

• е) 1 н. раствор едкого натрия (NaOH), х. ч. — 40 мл (готовят из фиксанала);

ж) калий йодноватистокислый 1 н. раствор, ч. д. а., х. ч. (35,67 г KIO3 растворяют в 1 л дистиллированной воды) — 5 мл.

Приготовление раствора Сомоджи.

Натрий углекислый и калий-натрий виннокислый растворяют в 200 мл горячей дистиллированной воды, добавляют раствор NaOH, перемешивают, после чего раствор кипятят для удаления СО2.

Натрий сернокислый растворяют в 500 мл горячей дистиллированной воды и нагревают до кипения. Оба раствора смешивают и добавляют калий йодистый, предварительно растворенный в малом количестве дистиллированной воды. Затем вливают раствор йодноватистокислого калия и после охлаждения доливают дистиллированной водой в мерной колбе до 1 л.

Через несколько дней раствор фильтруют (обычно через 2 дня). Реактив рекомендуется хранить при комнатной температуре, не подвергая его действию солнечного света. Если температура ниже 20°С, выпадают кристаллы натрия сернокислого, то перед употреблением реактив необходимо немного подогреть и растворить осадок. При высоких концентрациях сахара в крови (у мелких животных при сахарной нагрузке) можно использовать более разведенный фильтрат.

1. 2 н. раствор серной кислоты: берут 56 мл концентрированной серной кислоты (плотность 1,84) и доводят объем дистиллированной водой в мерной колбе до 1 л.

2. 0,005 н. раствор натрия серноватокислого 5-водного (гипосульфита натрия, Na2S2O3), ч. д. а. (готовят перед анализом из 0,1 н. раствора, приготовленного из фиксанала).

3. 1%-ный раствор крахмала, приготовленный в насыщенном растворе хлористого натрия.

Чтобы приготовить насыщенный раствор NaCl, необходимо при кипячении дистиллированной воды добавлять к ней при перемешивании NaCl до тех пор, пока не образуется осадок, т. е. избыток NaCl останется нерастворенным. После чего к этому раствору добавляют необходимое количество растворимого крахмала.