противном случае расслоения смеси на две фазы не произойдет). Цилиндр закрывают притертой пробкой, энергично встряхивают до образования молокообразной взвеси и оставляют стоять на ночь для расслоения или содержимое переносят в пробирки и центрифугируют.
Верхний водно-спиртовой слой (≈40%), содержащий нелипидные вещества, удаляют микробиологической пипеткой, присоединенной к водоструйному насосу или к шприцу. При этом нельзя затрагивать пограничную (липопротеидную) пленку. Если она содержит много нелипидных соединений (рыхлая, белого цвета), то ее следует отмыть. Для этого по стенке цилиндра пипеткой наслаивают 1–2 мл смеси 2. Цилиндр осторожно поворачивают вокруг своей оси и смесь отсасывают. При необходимости эту операцию повторяют 2–3 раза. Утонченную пленку растворяют каплями метанола.
В нижнем хлороформном слое (≈60%) концентрируются липиды. Для определения количества экстрагированных из исследуемой пробы липидов можно использовать два метода.
- Исходный экстракт переносят в предварительно обезжиренную и взвешенную колбу со шлифом, присоединяют к роторному испарителю и отгоняют хлороформ под вакуумом (присоединяя к водоструйному насосу) с подогревом до 40°С. Эта операция занимает 5–7 мин.
Если на стенке отгонной колбы остаются капли воды, их удаляют добавлением 0,2–0,3 мл ацетона с последующей его отгонкой.
После этого колбы с липидами тщательно протирают полотенцем и в открытом состоянии помещают в эксикатор, заполненный влагопоглощающим веществом. Через 2–3 ч взвешивают на аналитических весах. Определяют количество липидов, добавляют в колбу определенное количество хлороформметаноловой смеси (для получения раствора нужной концентрации), тщательно растворяют липиды и переносят их в пробирку с притертой пробкой, продувают азотом, закрывают и хранят в холодильнике.
- Экстракт липидов доводят до определенного объема. 1–2 мл раствора переносят в предварительно взвешенный бюкс или небольшой стакан и помещают на песчаную баню под вытяжным шкафом или в термостат при 60°С. Высушивают до постоянной массы. На основании количества липидов, обнаруженных в высушенном объеме экстракта, определяют концентрацию конкретной фракции липидов в исследуемом субстрате в соответствии с нижеизложенными методиками.
Исходный или концентрированный экстракт после определения в нем концентрации липидов используют для определения содержания фосфолипидов, триацилглицеринов, холестерина или изучения жирнокислотного состава общих липидов.
4.5.2. Определение общих липидов в сыворотке крови с сульфофосфованилиновым реактивом (по Целнеру – Киршу в изложении Л. В. Орлова)
Принцип. Метод основан на цветной реакции продуктов распада ненасыщенных липидов в серной кислоте с реактивом, состоящим из ванилина и ор-
тофосфорной кислоты. Механизм цветной реакции заключается в том, что ненасыщенные липиды реагируют с серной кислотой при нагревании с образованием карбониевого иона, взаимодействие которого с активированной карбоксильной группой ванилина фосфата образует стабильный комплекс. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию общих липидов в сыворотке крови.
Реактивы.
-
Серная кислота, концентрированная (х. ч.).
-
Ортофосфорная кислота, концентрированная (х. ч.).
-
Ванилин (х. ч.), 0,6%-ный раствор: 0,6 г ванилина растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды с нагреванием на водяной бане, после охлаждения доводят объем до 100 мл. Раствор стабилен при хранении при комнатной температуре.
-
Фосфор-ванилиновый реактив: 4 части ортофофорной кислоты смешивают с 1 частью 0,6%-ного раствора ванилина. Смесь хранят в темной склянке при комнатной температуре.
-
Хлороформ (х. ч. или для наркоза).
-
Стандартный раствор в хлороформе триолеина или холестерина (х. ч.) со свежим топленым и профильтрованным сливочным маслом в соотношении 1:3, или общие липиды, выделенные из сыворотки крови или печени. Взвешивают на аналитических весах в мерной колбе на 100 мл 1200 мг триолеина или другие указанные липиды и доводят хлороформом объем до метки. Хранят в темной склянке с притертой пробкой в холодильнике.
Оборудование: ФЭК или спектрофотометр; водяная баня; термостат; колбы мерные; пипетки; пробирки.
Ход определения. В пробирки (высотой 15 см) с 0,01 мл сыворотки крови добавляют 0,5 мл концентрированной серной кислоты. Содержимое пробирок тщательно перемешивают и ставят в кипящую водяную баню или термостат при температуре 130°С на 20 мин. Водяная баня должна быть заполнена водой не ниже уровня жидкости в пробирках, поставленных в нее. Используемые для анализа пробирки и другую посуду моют отдельно, тщательно ополаскивают дистиллированной водой и спиртом. Через 20 мин пробирки охлаждают под водопроводной водой, приливают 1,5 мл фосфор-ванилинового реактива, тщательно встряхивают и выдерживают в темноте при комнатной температуре 45 мин. Содержимое пробирки постепенно меняет желтый цвет на красный, который стабильно удерживается до 18 ч.
Через 1 ч определяют оптическую плотность на ФЭКе или спектрофотометре при зеленом фильтре (500–560 нм) в кювете с толщиной слоя 0,5–1 см против холостой пробы. Холостую пробу готовят так же, как и опытную, но вместо сыворотки берут 0,01 мл воды. Если концентрация липидов низкая и недостаточно улавливается на ФЭКе, то для исследования берут двойную дозу сыворотки (0,02 мл).
Расчет ведут по калибровочному графику. Для его построения из стандартного раствора триолеина готовят рабочие калибровочные растворы (табл. 4.1).
Приготовление рабочих растворов для построения калибровочного графика
| № пробирки | Стандартный раствор триолеина, мл | Хлороформ, мл | Концентрация общих липидов, мг% |
|---|---|---|---|
| 1 | 0,17 | 0,83 | 200 |
| 2 | 0,33 | 0,67 | 400 |
| 3 | 0,50 | 0,50 | 600 |
| 4 | 0,67 | 0,33 | 800 |
| 5 | 0,83 | 0,17 | 1000 |
| 6 | 1,00 | — | 1200 |
Берут по 0,01 мл каждого разведения калибровочного раствора и выполняют те же операции, что и с опытными пробами (обязательно выдерживают в водяной бане точно так же, как и пробирки с исследуемой сывороткой). В противном случае цветная реакция с фосфор-ванилиновым реактивом не наступает или будет очень слабой, нехарактерной. Холостую пробу с дистиллированной водой можно не выдерживать в водяной бане.
На основании полученных данных строят калибровочный график.
Прямолинейная зависимость между концентрацией общих липидов и оптической плотностью сохраняется до 1200 мг%. Поэтому при большей концентрации сыворотку крови разводят физраствором и результаты умножают на разведение.
Для определения этим методом содержания общих липидов в тканях животных необходимо свежую или замороженную ткань подвергнуть десмолизу в 33%-ном растворе калия гидроксида. В пробирку помещают 200 или 300 мг ткани, прибавляют 3 мл 33%-ного калия гидроксида и выдерживают на кипящей водяной бане 60–120 мин, периодически встряхивая. Содержимое пробирок доводят дистиллированной водой до 5 мл и тщательно перемешивают. Из этого содержимого берут 0,2 мл в другую пробирку, приливают 1 мл серной кислоты и кипятят в бане или выдерживают в термостате при температуре 130°С в течение 20 мин. После охлаждения приливают 2 мл фосфорванилинового реактива и дальнейшие операции проводят так же, как описано выше с сывороткой крови. Однако в этом случае при исследовании на ФЭКе удобнее пользоваться кюветами с толщиной слоя 0,5 см.
Общие липиды — обобщенное понятие, включающие НЭЖК, триглицериды, фосфолипиды, свободный и эстерифицированный холестерин, сфингомиелины.
Физиологическая концентрация в сыворотке крови составляет 140– 550 мг%. Патологические изменения содержания липидов в крови происходят в основном в виде увеличения концентрации — гиперлипидемии, касаясь одного или группы липидов.
4.5.3. Определение содержания фосфолипидов (по Бартлетту – Ушеру)
Принцип. Метод основан на минерализации липидов с помощью хлорной кислоты. Неорганический фосфор, взаимодействуя с аммония молибдатом, об-
