разует фосфомолибденовую кислоту, которую восстанавливают эйконогеном и натрия пиросульфитом в молибденовую синь. По степени окраски, определяемой колориметрически, вычисляют количество неорганического фосфора, содержащегося в фосфолипидах. Фосфолипиды стабильны в сыворотке или в плазме крови в течение 1 дня при комнатной температуре, 1 недели при хранении в холодильнике.
Реактивы.
-
Экстракционная смесь Фолча (хлороформ-метанол, 2:1).
-
72%-ная хлорная кислота (НСIO ~~4~~ ) или смесь равных объемов 60%-ной хлорной и 95–97%-ной серной кислот (плотность 1,84).
-
5%-ный раствор аммония молибдата [(NН4)6 × Мо7O24 × Н2О] (по объ-
ему).
- Сульфит-сульфоновый реактив. 13 г пиросульфита натрия (Na2S2O5), 0,5 г сульфита натрия (Na2SO3) и 0,25 г эйконогена (1-амино-2-нафтол-4сульфоновая кислота) растворяют в 100 мл дистиллированной воды (перегнанной в стеклянном дистилляторе) при постоянном встряхивании в течение 1 ч. Фильтруют через бумажный фильтр (лучше через синтетический № 4) и хранят в темной склянке. Реактив готовят еженедельно.
Оборудование: ФЭК или спектрофотометр; песчаная баня; водяная баня; колбочки плоскодонные на 50 и 100 мл; воронки; пробирки с притертыми пробками и делениями на 10 мл; пипетки.
Ход определения. Для анализа берут 0,5 мл сыворотки крови, 0,5 г гомогената тканей или 0,2–0,4 г желтка и экстрагируют по методу Фолча. В две параллельные пробирки вносят экстракт липидов в объеме, соответствующем 0,1 мл сыворотки крови, 0,02 г тканей или 0,01 г яичного желтка, добавляют по 0,6 мл хлорной кислоты и ставят на песчаную баню для сжигания при 180о С.
После просветления содержимого (через 1–1,5 ч) пробирки охлаждают и, тщательно перемешивая, последовательно добавляют следующие реактивы: по 4 мл дистиллированной воды, по 0,2 мл сульфит-сульфонового реактива и по 0,2 мл раствора аммония молибдата. Затем пробирки закрывают и помещают в водяную баню при 100°С на 10 мин. После охлаждения колориметрируют при длине волны 660 или 830 нм в кюветах с толщиной слоя 0,5–1 см против контрольной пробы (без липидов).
Расчет ведут по калибровочному графику, для построения которого используют двузамещенный фосфорнокислый калий (К2НРО4), высушенный до постоянной массы. 2,194 г реактива растворяют в 500 мл бидистиллированной воды. 1 мл раствора содержит 1 мг фосфора. Из основного раствора готовят рабочий раствор путем 50-кратного разведения водой (в 1 мл содержится 20 мкг фосфора). Если определение оптической плотности проводят на ФЭКе, то калибровочный график строят в пределах от 0,2 до 20 мкг, если же на спектрофотометре, то от 5 до 60 мкг фосфора (табл. 4.2).
Из каждого разведения берут по 2 мл калибровочного раствора, вносят в 2–3 параллельные пробирки и далее проделывают все операции, как описано выше. На основании полученных данных строят калибровочный график.
Приготовление растворов для построения калибровочного графика
| № пробирки | Рабочий раствор K2НРО4, мл | Бидистиллированная вода | Концентрация фосфора, мкг/мл |
|---|---|---|---|
| 1 | 0,1 | 9,9 | 0,2 |
| 2 | 0,3 | 9,7 | 0,6 |
| 3 | 0,5 | 9,5 | 1,0 |
| 4 | 2,5 | 7,5 | 5,0 |
| 5 | 5,0 | 5,0 | 10,0 |
| 6 | 7,5 | 2,5 | 15,0 |
| 7 | 10,0 | — | 20,0 |
Содержание общих фосфолипидов обычно выражают через количество содержащихся в них фосфатов — в ммоль/1 л, содержание отдельных фракций — также через содержание фосфатов или в процентах по отношению к сумме фосфора всех фосфолипидов.
Пересчет фосфора в фосфолипидах путем умножения на 25 нельзя признать правильным, так как это соответствует только для фосфотидилхолинов (лецитинов), в молекуле которых содержится 4% фосфора. В других подклассах фосфолипидов доля фосфора иная.
Клиническое значение. Фосфолипиды поступают в кровь главным образом из печени, поэтому их уровень тесно связан с функциональным состоянием данного органа. Концентрация общих фосфолипидов в норме составляет у крупного рогатого скота 170–250 мг/100 мл, у свиней — 90–200 мг/100 мл. Повышение концентрации фосфолипидов в сыворотке крови отмечается при стеотозе (жировой дегенерации) печени, тяжелой форме сахарного диабета, нефрозе и нефрите, постгеморрагической анемии. Снижение уровня фосфолипидов — частый признак острого и хронического гепатита различной этиологии; оно отмечается также при неполноценном кормлении, особенно белкововитаминной недостаточности, при дисбалансе аминокислот в рационе, алиментарной дистрофии, анемиях.
4.5.4. Определение содержания триацилглицеринов (по Сардесаю и Маннингу)
Принцип. Метод представляет собой модификацию метода Ван-Ханделя и Зильверсмита (1957) для прямого определения триацилглицеринов. Глицерол, освобожденный омылением, окисляется до формальдегида, концентрация последнего определяется колориметрически с применением реакции Hantzsch. Данный метод позволяет выявить триацилглицерины во всех биологических субстратах — сыворотке крови, печени, мышцах, жировой ткани и др.
Кровь с гепарином или с ЭДТА может храниться в вакуумной пробирке в течение 8 ч. Пробы не замораживают.
Реактивы.
-
Экстрагирующая смесь (хлороформ-метанол 2:1 или спирт-эфир 3:1).
-
Кремниевая кислота (силикагель), активированная при 105°С в течение 10–12 ч.
-
Спиртовой раствор калия гидроксида (KОН). 2 г KОН растворяют в минимальном количестве дистиллированной воды и объем доводят 95%-ным этиловым спиртом до 100 мл (основной раствор). Для приготовления рабочего раствора 10 мл основного раствора доводят 95%-ным этиловым спиртом до 50 мл (готовят в день применения).
-
0,1 моль/л раствор серной кислоты.
-
0,05 моль/л раствор метперйодата (NaIO ~~4~~ ).
-
0,5 моль/л раствор натрия арсенита (NaAsO ~~2~~ ).
-
Ацетил-ацетоновый реактив, рН 6,0 при 25°С.
150 г аммония ацетата, 3 мл ледяной уксусной кислоты и 2 мл ацетилацетонового реактива растворяют в 1 л дистиллированной воды. Реактив стоек в течение 2 недель при хранении в холодильнике.
-
1%-ный стандартный раствор триацилглицеринов.
-
1 триолеина или оливкового масла растворяют в 100 мл хлороформа.
-
Хранят в холодильнике, раствор стоек 2 месяца.
Оборудование: спектрофотометр или ФЭК; водяная баня; пробирки обычные и центрифужные с делением; колбочки или пробирки на 10 мл; делительные воронки на 25 и 50 мл.
Ход определения. 0,1 мл сыворотки (плазмы) вносят в колбочку, заливают экстрагирующей смесью и тщательно перемешивают. Через 2–3 мин содержимое пропускают через обезжиренный бумажный фильтр в мерную колбочку, доводят объем экстрагирующей смесью до 10 мл. В делительную воронку на 25 мл вносят 8 мл дистиллированной воды и 8 мл фильтрата (что соответствует 0,08 мл сыворотки). Содержимое хорошо перемешивают, отстаивают и нижний слой пропускают через стеклянную колонку размером 0,8 × 16 см (для задержки фосфолипидов), приготовленную следующим путем: в центрифужную пробирку со спиленным дном помещают кусочек стеклянной ваты и 0,5 г активированной кремовой кислоты. Перед использованием колонку промывают 5 мл хлороформа. Фильтрат пробы собирают в мерную колбочку на 10 мл или пробирку с делениями. Колонку промывают хлороформом, который также собирают в колбочку. Объем доводят хлороформом до метки. Затем в 3 пробирки вносят по 3 мл фильтрата (что соответствует 0,024 мл сыворотки или плазмы) и после выпаривания растворителя в водяной бане в первые две пробирки добавляют по 0,5 мл спиртового раствора KОН (омыляемые пробы), а в третью — 0,5 мл спирта (неомыляемая проба). Пробирки инкубируют в водяной бане 15 мин при 60°С. В конце инкубации в каждую из них добавляют по 0,5 мл 0,2 н. раствора серной кислоты, а затем по 0,1 мл 0,05 моль/л раствора метперйодата натрия (для окисления глицерина, освобожденного омылением).
Через 10 мин (ровно!) окисление приостанавливают добавлением по 0,1 мл 0,5 моль/л раствора натрия арсенита. Через 5–7 мин, когда испарится освободившийся йод, пробирки извлекают из бани и в них добавляют по 0,8 мл воды и по 2 мл ацетил-ацетонового реактива. Содержимое тщательно перемешивают перевертыванием пробирки и инкубируют в водяной бане при 58°С в течение 10 мин. Затем пробирки охлаждают до комнатной температуры и колориметрируют при длине волны 412 нм в кювете с толщиной слоя 0,5 см против
