ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
4.1. Отбор и подготовка проб крови для исследований
Пробирки для отбора проб крови ветеринарные специалисты хозяйств подбирают следующим образом: на каждое животное по 2 биологические пробирки (№ 1 и 2, объем не менее 20 мл, если объем пробирки 20 мл, то следует приготовить 3 пробирки, соответственно № 1, 2(А) и 2(Б), и по 2 центрифужные № 3 и 4, объем 11–12 мл). В пробирку № 1 для получения цельной крови и плазмы предварительно вносят по 2–3 капли 1%-ного раствора гепарина. На каждые 15–20 мл крови. В случаях когда содержание натрия в плазме крови не определяется, вместо гепарина можно использовать лимоннокислый или щавелевокислый натрий по 15–20 мг на каждые 15–20 мл крови. Пробирка № 2 (№ 2(А) и 2(Б)) остается сухой для получения сыворотки. В одну из центрифужных пробирок (№ 3) вносят 0,5 мл вазелинового масла и каплю 1%-ного раствора гепарина, в другую (№ 4, градуированную) — 5 мл 20%-ного раствора ТХУ.
Все пробирки закрывают резиновыми пробками. Пробирку № 4 помещают в термос со льдом.
Пробы крови берут у животных перед кормлением или через 5–6 ч после кормления. У жвачных забор крови осуществляют из яремной вены. Лучшим местом для ее прокола является средняя треть шеи. При перемещении точки прокола к голове возможно повреждение сонной артерии. Для уточнения места расположения яремного желоба несколько ниже предполагаемого места прокола вену пережимают жгутом (обычно используют резиновую трубку). Вена наполняется кровью и становится отчетливо заметна.
Кровь набирают в пробирки № 1, 2 (2(А) и 2(Б)) и 3 по стенке во избежание гемолиза (в пробирку забирают кровь, не доливая ее до края 2–2,5 см). Кровь в пробирках № 1 и 3 осторожно перемешивают путем 3-кратного перевертывания пробирок. В градуированную пробирку № 4 с раствором ТХУ приливают из пробирки № 1 5 мл крови (до отметки 10 мл) и тщательно перемешивают стеклянной палочкой.
Пробирки № 1, 3 и 4 ставят в термос со льдом, пробирку № 2 (2(А) и 2(Б)) транспортируют летом обычным путем, а зимой предохраняют от замерзания.
В лаборатории или в кабинете ветврача на ферме кровь в пробирке № 2 (2(А) и 2(Б)) обводят тонкой спицей из нержавеющей стали диаметром 1,0– 1,5 мм и ставят в термостат при температуре 37–38°С для окончательного отделения сыворотки. Отделившуюся сыворотку в лабораторию доставляют свежей не позднее 24 ч с момента взятия крови в количестве 7–10 мл, негемолизированную и с плотно закрытыми пробками. В лаборатории сыворотку вливают в центрифужные пробирки и центрифугируют 20–30 мин при 2000–3000 об/мин.
В сыворотке крови определяют содержание общего белка, белковых фракций, мочевины, общих липидов, общего холестерина, общего кальция, йода неорганического, связанного с белками (СБЙ), активность щелочной фосфатазы и др.
Для получения плазмы кровь в пробирках с антикоагулянтом (№ 1) осторожно перемешивают, наливают в центрифужные пробирки и центрифугируют 20–30 мин при 2000–3000 об/мин. Плазму переносят в другие пробирки и хранят в холодильнике.
В плазме крови определяют содержание натрия, калия, каротина, витаминов А и С.
В цельной крови из пробирки № 1 определяют гематокрит, кетоновые тела, медь, цинк, кобальт, марганец.
Кровь в пробирке № 3 с вазелиновым маслом центрифугируют 20–30 мин при 2000–3000 об/мин. В плазме определяют содержание СО2 (щелочной резерв).
Смесь крови и ТХУ в пробирке № 4 центрифугируют в течение 20– 30 мин при 2000–3000 об/мин. Верхний слой (безбелковый фильтрат) сливают в другую пробирку и в ней определяют глюкозу, неорганический фосфор и неорганический магний. Безбелковый фильтрат крови хранят в холодильнике не более 5 дней.
4.2. Методы определения глюкозы в крови
4.2.1. Определение глюкозы в безбелковом фильтрате крови
по цветной реакции с ортотолуидином
Принцип метода. Глюкоза при нагревании с ортотолуидином в растворе уксусной кислоты образует соединение, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации глюкозы.
Реактивы.
1) Ортотолуидин ч. желтого цвета; 2) ледяная уксусная кислота, х. ч.; 3) тиомочевина, ч. д. а.; 4) ТХУ, ч. д. а., х. ч.; 5) бензойная кислота, ч. д. а., х. ч.; 6) глюкоза, ч. д. а.;
Подготовка реактивов .
- Ортотолуидин ч. желтого цвета, обязательно подлежит перегонке в колбе-реторте при 200°С (на песочной бане); свежеприготовленный ортотолуидин должен быть бесцветным или слабо-желтого цвета. Экстинкция при 590– 655 нм против воды не должна превышать 0,02. Реактив стоек при хранении в посуде из темного стекла, без доступа воздуха.
Ортотолуидиновый реактив: в колбу на 100 мл вносят 94 мл ледяной уксусной кислоты и растворяют в ней 0,15 г тиомочевины, затем добавляют 6 мл ортотолуидина (подвергнутого перегонке). Полученный реактив стоек при хранении в холодильнике.
-
20%-ный раствор ТХУ: берут 20 г ТХУ, помещают в мерную колбу объемом 100 мл и добавляют дистиллированной воды до метки, тщательно перемешивают.
-
0,2%-ный раствор бензойной кислоты: 0,2 г кристаллической бензойной кислоты разводят в небольшом количестве воды (например, в пробирке), нагревают в водяной бане до полного растворения. После охлаждения до ком-
натной температуры переносят в мерную колбу на 100 мл и доливают до метки дистиллированной водой.
- Стандартный раствор глюкозы (концентрация 50 мг%): 50 мг глюкозы, высушенной в сушильном шкафу до постоянной массы при температуре 100°С, растворяют в 100 мл 0,2%-ного раствора бензойной кислоты. Бензойная кислота увеличивает стабильность стандартного раствора глюкозы. Хранят раствор в холодильнике.
Специальное оборудование и аппаратура. ФЭК, сушильный шкаф, колбареторта, песочная баня, колбы мерные на 100 мл, лабораторный автотрансформатор, центрифуга, водяная баня, пробирки химические, пробирки центрифужные, термометр лабораторный на 150°С, штативы для пробирок, холодильник бытовой, термос на 3–5 л.
Материал для исследования. Материалом служит безбелковый фильтрат крови, полученный путем смешивания и последующего центрифугирования равных объемов 20%-ного раствора трихлоруксусной кислоты и цельной крови.
Ход определения. В пробирку вносят 0,2 мл безбелкового фильтрата крови, 0,3 мл дистиллированной воды и 4,5 мл ортотолуидинового реактива. Пробирку помещают в кипящую водяную баню (вода должна постоянно кипеть) ровно на 8 мин, после чего сразу охлаждают до комнатной температуры под водопроводной водой. Фотометрируют против контроля при длине волны 590– 655 нм (оранжевый или красный светофильтр) в кювете толщиной 10 мм. В контрольную пробирку вносят 0,1 мл 20%-ного раствора ТХУ и 0,4 мл дистиллированной воды и 4,5 мл ортотолуидинового реактива.
Стандартная проба. Стандартные пробы ставят как опытные, но вместо безбелкового фильтрата берут 0,1 мл глюкозы с концентрацией 50 мг%, 0,1 мл 20%-ного раствора ТХУ, 0,3 мл дистиллированной воды и 4,5 мл ортотолуидинового реактива.
Расчеты результатов. Проводят их по формуле
Con = Ccm EEcm on ,
где Соп — концентрация глюкозы в пробе, мг%; Сст — концентрация глюкозы в стандарте, мг%; Еоп — оптическая плотность пробы; Ест — оптическая плотность стандарта.
Ошибка метода составляет ±2,5%.
4.2.2. Определение глюкозы в безбелковом фильтрате крови по методу Сомоджи
Принцип метода. Метод основан на окислении глюкозы в щелочной среде при кипячении с сернокислой медью. При йодометрическом определении образовавшаяся закись меди окисляется йодом. Последний освобождается подкислением определенного количества йодноватокислого калия и йодистого калия, а оставшийся свободный йод оттитровывается гипосульфитом.
Реактивы.
- 5%-ный раствор сернокислого цинка: 5 г сернокислого цинка 7-водного (ZnSO4 × 7H2O) растворяют в 95 мл дистиллированной воды.
