Приготовление растворов для построения калибровочного графика
| № пробирки | Рабочий раствор K2НРО4, мл | Бидистиллированная вода | Концентрация фосфора, мкг/мл |
|---|---|---|---|
| 1 | 0,1 | 9,9 | 0,2 |
| 2 | 0,3 | 9,7 | 0,6 |
| 3 | 0,5 | 9,5 | 1,0 |
| 4 | 2,5 | 7,5 | 5,0 |
| 5 | 5,0 | 5,0 | 10,0 |
| 6 | 7,5 | 2,5 | 15,0 |
| 7 | 10,0 | — | 20,0 |
Содержание общих фосфолипидов обычно выражают через количество содержащихся в них фосфатов — в ммоль/1 л, содержание отдельных фракций — также через содержание фосфатов или в процентах по отношению к сумме фосфора всех фосфолипидов.
Пересчет фосфора в фосфолипидах путем умножения на 25 нельзя признать правильным, так как это соответствует только для фосфотидилхолинов (лецитинов), в молекуле которых содержится 4% фосфора. В других подклассах фосфолипидов доля фосфора иная.
Клиническое значение. Фосфолипиды поступают в кровь главным образом из печени, поэтому их уровень тесно связан с функциональным состоянием данного органа. Концентрация общих фосфолипидов в норме составляет у крупного рогатого скота 170–250 мг/100 мл, у свиней — 90–200 мг/100 мл. Повышение концентрации фосфолипидов в сыворотке крови отмечается при стеотозе (жировой дегенерации) печени, тяжелой форме сахарного диабета, нефрозе и нефрите, постгеморрагической анемии. Снижение уровня фосфолипидов — частый признак острого и хронического гепатита различной этиологии; оно отмечается также при неполноценном кормлении, особенно белкововитаминной недостаточности, при дисбалансе аминокислот в рационе, алиментарной дистрофии, анемиях.
4.5.4. Определение содержания триацилглицеринов (по Сардесаю и Маннингу)
Принцип. Метод представляет собой модификацию метода Ван-Ханделя и Зильверсмита (1957) для прямого определения триацилглицеринов. Глицерол, освобожденный омылением, окисляется до формальдегида, концентрация последнего определяется колориметрически с применением реакции Hantzsch. Данный метод позволяет выявить триацилглицерины во всех биологических субстратах — сыворотке крови, печени, мышцах, жировой ткани и др.
Кровь с гепарином или с ЭДТА может храниться в вакуумной пробирке в течение 8 ч. Пробы не замораживают.
Реактивы.
-
Экстрагирующая смесь (хлороформ-метанол 2:1 или спирт-эфир 3:1).
-
Кремниевая кислота (силикагель), активированная при 105°С в течение 10–12 ч.
-
Спиртовой раствор калия гидроксида (KОН). 2 г KОН растворяют в минимальном количестве дистиллированной воды и объем доводят 95%-ным этиловым спиртом до 100 мл (основной раствор). Для приготовления рабочего раствора 10 мл основного раствора доводят 95%-ным этиловым спиртом до 50 мл (готовят в день применения).
-
0,1 моль/л раствор серной кислоты.
-
0,05 моль/л раствор метперйодата (NaIO ~~4~~ ).
-
0,5 моль/л раствор натрия арсенита (NaAsO ~~2~~ ).
-
Ацетил-ацетоновый реактив, рН 6,0 при 25°С.
150 г аммония ацетата, 3 мл ледяной уксусной кислоты и 2 мл ацетилацетонового реактива растворяют в 1 л дистиллированной воды. Реактив стоек в течение 2 недель при хранении в холодильнике.
-
1%-ный стандартный раствор триацилглицеринов.
-
1 триолеина или оливкового масла растворяют в 100 мл хлороформа.
-
Хранят в холодильнике, раствор стоек 2 месяца.
Оборудование: спектрофотометр или ФЭК; водяная баня; пробирки обычные и центрифужные с делением; колбочки или пробирки на 10 мл; делительные воронки на 25 и 50 мл.
Ход определения. 0,1 мл сыворотки (плазмы) вносят в колбочку, заливают экстрагирующей смесью и тщательно перемешивают. Через 2–3 мин содержимое пропускают через обезжиренный бумажный фильтр в мерную колбочку, доводят объем экстрагирующей смесью до 10 мл. В делительную воронку на 25 мл вносят 8 мл дистиллированной воды и 8 мл фильтрата (что соответствует 0,08 мл сыворотки). Содержимое хорошо перемешивают, отстаивают и нижний слой пропускают через стеклянную колонку размером 0,8 × 16 см (для задержки фосфолипидов), приготовленную следующим путем: в центрифужную пробирку со спиленным дном помещают кусочек стеклянной ваты и 0,5 г активированной кремовой кислоты. Перед использованием колонку промывают 5 мл хлороформа. Фильтрат пробы собирают в мерную колбочку на 10 мл или пробирку с делениями. Колонку промывают хлороформом, который также собирают в колбочку. Объем доводят хлороформом до метки. Затем в 3 пробирки вносят по 3 мл фильтрата (что соответствует 0,024 мл сыворотки или плазмы) и после выпаривания растворителя в водяной бане в первые две пробирки добавляют по 0,5 мл спиртового раствора KОН (омыляемые пробы), а в третью — 0,5 мл спирта (неомыляемая проба). Пробирки инкубируют в водяной бане 15 мин при 60°С. В конце инкубации в каждую из них добавляют по 0,5 мл 0,2 н. раствора серной кислоты, а затем по 0,1 мл 0,05 моль/л раствора метперйодата натрия (для окисления глицерина, освобожденного омылением).
Через 10 мин (ровно!) окисление приостанавливают добавлением по 0,1 мл 0,5 моль/л раствора натрия арсенита. Через 5–7 мин, когда испарится освободившийся йод, пробирки извлекают из бани и в них добавляют по 0,8 мл воды и по 2 мл ацетил-ацетонового реактива. Содержимое тщательно перемешивают перевертыванием пробирки и инкубируют в водяной бане при 58°С в течение 10 мин. Затем пробирки охлаждают до комнатной температуры и колориметрируют при длине волны 412 нм в кювете с толщиной слоя 0,5 см против
контроля. Степень поглощения омыляемой пробы минус степень поглощения неомыляемой пробы соответствует количеству триацилглицеринов, содержащихся в 0,24 мл исходного объема сыворотки (плазмы) крови. В используемом объеме сыворотки (плазмы) крови показания неомыляемых проб обычно очень малы и не имеют существенного значения.
Расчет ведут по формуле или калибровочному графику, который строят в пределах от 10 до 250 мкг/мл триацилглицеринов:
x = ( Е оп /Е ст) С ст,
где х — количество триацилглицеринов, мкг%; Е оп — экстинкция опытной пробы; Е ст — экстинкция стандартной пробы; С ст — концентрация триолеина в стандартном растворе, мг%.
Из основного раствора готовят серию рабочих калибровочных растворов (табл. 4.3).
Таблица 4.3
Приготовление рабочих калибровочных растворов
| № пробирки | Стандартный раствор, мл | Хлороформ, мл | Концентрация триацил- глицеринов, мкг/мл |
|---|---|---|---|
| 1 | 0,1 | 9,9 | 10 |
| 2 | 0,5 | 9,5 | 50 |
| 3 | 1,0 | 9,0 | 100 |
| 4 | 1,0 | 4,0 | 200 |
| 5 | 1,0 | 3,0 | 250 |
В пять опытных пробирок вносят по 1 мл каждого рабочего раствора и в шестую пробирку — 1 мл хлороформа для контроля на реактивы. Все пробирки помещают в кипящую баню на 10 мин для удаления хлороформа. Затем в них добавляют по 0,5 мл спиртового раствора калия гидроксида и процедуру продолжают, как описано выше.
Примечания.
-
Для анализа лучше использовать плазму крови, полученную на холоде, так как при получении сыворотки происходит частичный гидролиз триацилглицеринов.
-
В качестве антикоагулянта применяют ЭДТА натриевой или калиевой соли (1 мг на 1 мл крови). Гепарин применять не следует, так как он активирует липопротеидную липазу, гидролизирующую триацилглицерины.
Клиническое значение. Концентрация триацилглицеринов (нейтральных жиров) в сыворотке крови животных повышается при скармливании кормов, обогащенных жирами или богатых легкодоступными углеводами (картофель, зерно кукурузы, пшеницы и др.), активизирующих липогенез в печени (у моногастричных). Недостаток в рационах протеина и липотропных веществ (холина, метионина, треонина, селена, витамина Е, никотиновой кислоты и др.) также сопровождается нарастанием уровня нейтральных липидов в сыворотке крови животных. Увеличение концентрации триацилглицеринов отмечается при острых гепатитах, жировой дистрофии печени, нефрозах, диабете. Снижение их концентрации наблюдается при низком уровне кормления животных, усиленной молокоотдаче.
