свидетельствует о наличии в сыворотке крови более 10 мг/100 мл (10 мг%) ацетона и ацетоуксусной кислоты (такова степень чувствительности реактива). Чем интенсивнее окраска, тем больше ацетоновых тел в исследуемой жидкости.
Если интенсивное фиолетовое окрашивание возникает немедленно, это свидетельствует о наличии в пробе 50–80 мг% и более АсАс. При появлении интенсивной фиолетовой окраски через 1 мин в пробе содержится 30–50 мг% АсАс, слабая голубая окраска после 3 мин — 10–30 мг% АсАс.
Полуколичественное определение кетоновых тел в сыворотке крови.
С этой целью сыворотку разводят дистиллированной водой. При содержании АсАс 30–50 мг% делают разведение 1:3, 1:4, 1:5, 1:6. В пробе с наибольшим разведением, дающим положительную реакцию, содержится 10 мг% АсАс. Умножая результат на разведение сыворотки, получаем содержание АсАс в неразведенной пробе.
Например, получена положительная проба сыворотки 1:4 и отрицательная при разведении 1:5 и 1:6. Значит, 10 мг% × 4 = 40 мг% АсАс в исследуемой пробе сыворотки крови.
Определение кетоновых тел в свежеполученных моче и молоке делается так же, как и в сыворотке крови.
Следует помнить, что экспресс-методы определения кетоновых тел чувствительны лишь к одной из их фракций (ацетону с ацетоуксусной кислотой), а соотношение фракций кетоновых тел в крови, моче молоке различно. В крови здоровых коров 70–90% приходится на фракцию ВН, в нормальном молоке она составляет 87–92% от ОКТ, с мочой в основном выделяется АсАс. В прокисшем молоке ацетоуксусная кислота легко превращается ацетон.
Определение фракции ВН в моче.
В стаканчик на 50 мл помещают 10 мл мочи, приливают к ней 10 мл дистиллированной воды и несколько капель уксусной кислоты. Упаривают под тягой жидкость в стакане до половины первоначального объема. При этом отгоняется ацетон и разрушается ацетоуксусная кислота, а бета-оксимасляная кислота остается неразрушенной. Дают жидкости остыть и переливают ее в пробирку. Прибавляют в пробирку 1 мл перекиси водорода, нагревают 1 мин и дают остыть. Бета-оксимасляная кислота окисляется в ацетоуксусную. Обнаруживают ее реактивом Лестраде.
4.5. Методы оценки состояния липидного обмена
4.5.1. Метод экстракции липидов хлороформ-метаноловой смесью (по Фолчу)
Принцип. Метод заключается в разрушении липидно-белковых связей полярными растворителями (в данном случае метанолом), что облегчает последующее экстрагирование липидов неполярными растворителями (хлороформом, диэтиловым или петролейным эфиром). В данном случае полярные и неполярные растворители представлены в виде одной смеси. Метод пригоден для извлечения липидов из любых тканей животного и растительного происхожде-
ния. В настоящее время считается универсальным. Обязательное требование данного метода — соблюдение соотношения субстрата и растворителя 1:20.
Реактивы.
-
Хлороформ. Из хлороформа необходимо удалить фосген, который реагирует с окси- и аминогруппами липидов. Свежий, имеющийся в продаже хлороформ достаточно перегнать и хранить в темной бутылке с добавлением 1% метанола (или этанола), который препятствует образованию фосгена.
-
Метанол освобождают от альдегидов перегонкой над гранулированным
калия гидроксидом. Перегнанный метанол хранят в темной бутылке 1–2 мес.
-
Смесь хлороформ-метанола в соотношении 2:1 по объему (смесь 1).
-
Смесь растворителей верхней фазы, содержащая минеральные соли (смесь 2): хлороформ-метанол-водный раствор соли в соотношении 3:48:47 по объему (т. е. отмерять каждый раствор в миллилитрах). В качестве солей могут быть использованы KСl (0,75%), NaCl (0,58%) или СаСl2 (0,04%).
-
Антиоксидант бутилокситолуол (БОТ, ионол).
Оборудование: пробирки обычные и с притертыми пробками вместимостью 10, 20 и 50 мл; цилиндры мерные с притертыми пробками вместимостью 25, 50 и 100 мл; конические колбочки с плоским дном обычные и с притертыми пробками на 50 и 100 мл; пипетки с делениями разных объемов; гомогенизатор; водоструйный насос; роторный испаритель; аналитические весы.
Ход определения. В пробирку или колбу наливают необходимое количество смеси 1, из пипетки вносят необходимый объем сыворотки (плазмы) крови или молока (например, 40 мл хлороформ-метаноловой смеси и 2 мл сыворотки в соотношении 1:20). Чтобы избежать окисления липидов, к пробам добавляют антиоксидант бутилокситолуол (БОТ), который вносят с метанолом в количестве 0,1% от количества липидов. Смесь тщательно перемешивают стеклянной палочкой или покачиванием колбы и оставляют стоять или подогревают на водяной бане при 40–45°С 2–3 мин, затем фильтруют через обезжиренный бумажный или стеклянный фильтр в мерный цилиндр на 50 мл с притертой пробкой.
Желток яйца вносят в предварительно взвешенную колбочку, взвешивают и заливают смесью 1.
Печень или мышечную ткань отвешивают, помещают в стакан гомогенизатора, добавляют такое же количество физраствора и гомогенизируют 2– 3 мин. Затем отвешивают необходимое количество (2–6 г) гомогената в плоскодонную колбочку, заливают 20 частями смеси 1, тщательно перемешивают стеклянной палочкой, оставляют стоять в течение 1 ч или подогревают на водяной бане в течение 5–10 мин и потом фильтруют в мерный цилиндр.
Для экстракции липидов из кормов или сухих образцов животных тканей их измельчают, заливают смесью 1, колбочки закрывают пробкой и оставляют для экстракции на 18–24 ч (с периодическим перемешиванием) или встряхивают на шугтель-аппарате в течение 1,5–2 ч. Содержимое подогревают при 45– 50°С 5–10 мин и фильтруют.
Для удаления нелипидных соединений из экстракта к последнему добавляют 1/5 объема воды (это соотношение следует строго соблюдать, так как в
противном случае расслоения смеси на две фазы не произойдет). Цилиндр закрывают притертой пробкой, энергично встряхивают до образования молокообразной взвеси и оставляют стоять на ночь для расслоения или содержимое переносят в пробирки и центрифугируют.
Верхний водно-спиртовой слой (≈40%), содержащий нелипидные вещества, удаляют микробиологической пипеткой, присоединенной к водоструйному насосу или к шприцу. При этом нельзя затрагивать пограничную (липопротеидную) пленку. Если она содержит много нелипидных соединений (рыхлая, белого цвета), то ее следует отмыть. Для этого по стенке цилиндра пипеткой наслаивают 1–2 мл смеси 2. Цилиндр осторожно поворачивают вокруг своей оси и смесь отсасывают. При необходимости эту операцию повторяют 2–3 раза. Утонченную пленку растворяют каплями метанола.
В нижнем хлороформном слое (≈60%) концентрируются липиды. Для определения количества экстрагированных из исследуемой пробы липидов можно использовать два метода.
- Исходный экстракт переносят в предварительно обезжиренную и взвешенную колбу со шлифом, присоединяют к роторному испарителю и отгоняют хлороформ под вакуумом (присоединяя к водоструйному насосу) с подогревом до 40°С. Эта операция занимает 5–7 мин.
Если на стенке отгонной колбы остаются капли воды, их удаляют добавлением 0,2–0,3 мл ацетона с последующей его отгонкой.
После этого колбы с липидами тщательно протирают полотенцем и в открытом состоянии помещают в эксикатор, заполненный влагопоглощающим веществом. Через 2–3 ч взвешивают на аналитических весах. Определяют количество липидов, добавляют в колбу определенное количество хлороформметаноловой смеси (для получения раствора нужной концентрации), тщательно растворяют липиды и переносят их в пробирку с притертой пробкой, продувают азотом, закрывают и хранят в холодильнике.
- Экстракт липидов доводят до определенного объема. 1–2 мл раствора переносят в предварительно взвешенный бюкс или небольшой стакан и помещают на песчаную баню под вытяжным шкафом или в термостат при 60°С. Высушивают до постоянной массы. На основании количества липидов, обнаруженных в высушенном объеме экстракта, определяют концентрацию конкретной фракции липидов в исследуемом субстрате в соответствии с нижеизложенными методиками.
Исходный или концентрированный экстракт после определения в нем концентрации липидов используют для определения содержания фосфолипидов, триацилглицеринов, холестерина или изучения жирнокислотного состава общих липидов.
4.5.2. Определение общих липидов в сыворотке крови с сульфофосфованилиновым реактивом (по Целнеру – Киршу в изложении Л. В. Орлова)
Принцип. Метод основан на цветной реакции продуктов распада ненасыщенных липидов в серной кислоте с реактивом, состоящим из ванилина и ор-
