бавлением хромовой смеси и последующим кипячением. В дистилляте определяют весь перегнанный ацетон, связывая его йодом. Ацетон с йодом в щелочной среде образует йодоформ и йодистый натрий. Избыток йода удаляют добавлением серной кислоты, что определяют при помощи титрования раствором гипосульфита. По разности между контролем и опытом находят связанный йод.
Реактивы.
-
0,3 н. (0,3 моль/л) раствор едкого натра: 1,2 NaOH помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки дистиллированной водой.
-
5%-ный раствор сернокислого цинка (ZnSO ~~4~~ × 7H ~~2~~ 0): 5 г ZnSO4 помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки дистиллированной водой.
-
Бихроматная смесь. Реактивы: 20 г двухромовокислого калия, 200 мл концентрированной серной кислоты, дистиллированная вода до 1 л.
Приготовление бихроматной смеси:
В мерную колбу на 1 л вливают 400–600 мл дистиллированной воды, осторожно приливают 200 мл концентрированной серной кислоты, постоянно помешивая, затем добавляют 20 г мелкоистолченного двухромовокислого калия. После растворения вещества и остывания реактива доливают дистиллированной водой до метки.
-
20%-ный раствор серной кислоты (по объему): в мерную колбу на 100 мл вливают 20 мл концентрированной серной кислоты и добавляют (дробно) 80 мл дистиллированной воды.
-
10%-ный раствор едкого натра: 10 г NaOH помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки дистиллированной водой.
-
0,01 н. (0,005 моль/л) раствор йода (готовят перед анализом из 0,1 н. раствора, приготовленного из фиксанала). Титр 0,01 н. раствора йода каждый раз проверяют по 0,01 н. раствору натрия тиосульфата (гипосульфит).
-
0,01 н. (0,01 моль/л) раствор натрия серноватистокислого, 5-водного Nа2SО3 × 5Н2О (готовят из 0,1 н. (0,1 моль/л) раствора, приготовленного из фиксанала).
-
1%-ный раствор крахмала (см. 55). Раствор стоек; с йодом должен давать чисто-синее окрашивание.
Оборудование. Прибор (перегонный аппарат) для определения кетоновых тел (20–30 шт.), его монтируют в вытяжном шкафу; электроплитки (8–10 шт.); микробюретки на 2 и 5 мл; стаканчики химические на 75–100 мл.
Ход определения.
А. Приготовление безбелкового фильтрата по Сомоджи.
К 5 мл крови добавляют 25 мл дистиллированной воды, 10 мл 0,3 н. раствора едкого натра, перемешивают, затем добавляют 10 мл 5%-ного раствора сернокислого цинка, все тщательно взбалтывают и через 10 мин фильтруют через бумажный фильтр. Разведение крови таким образом будет 1:10.
Б. Определение общего количества кетоновых тел.
Непосредственно перед работой включают холодильник и аппарат просасывают 20 мин текучим паром, налив в перегонную колбу дистиллированную воду и добавив в нее немного пемзы для равномерного кипения.
В приемный стаканчик вносят 20 мл дистиллированной воды, 2 мл 0,01 н. раствора йода, 2 мл 10%-ного раствора едкого натра и ставят под холодильник перегонного аппарата, чтобы конец его погрузился в жидкость. В перегонную колбу вносят 10 мл фильтрата крови, 15 мл бихроматной смеси и 10 мл дистиллированной воды. Параллельно готовят контроль в двух аппаратах: в перегонную колбу вносят 20 мл дистиллированной воды и 15 мл бихроматной смеси. Приборы закрывают, соединяют холодильники с водой и включают электроплитки. Опытные образцы кипятят 25 мин, контрольные — 15 мин. Отключают нагрев, снимают перегонную колбу, холодильник смывают небольшим количеством дистиллированной воды. Приемный стаканчик закрывают крышкой и ставят в темное место на 15–20 мин. По истечении указанного срока в приемный стаканчик быстро приливают 2 мл 20%-ного раствора серной кислоты, добавляют 2–3 капли 1%-ного раствора крахмала и титруют 0,01 н. раствором гипосульфита до обесцвечивания.
Расчет ведут по формуле
X мг% = ( А – В ) × 0,25 × 100,
где X — количество кетоновых тел в мг%; А — количество мл 0,01 н. раствора гипосульфата, пошедшего на титрование свободного йода в контрольной пробе; В — количество миллилитров 0,01 н. раствора гипосульфита, пошедшего на титрование свободного йода в опытной пробе; 1 мл 0,01 н. раствора йода связывает в данных условиях 0,25 мг ацетона; 100 — коэффициент перевода, мг%.
В. Определение ацетона и ацетоуксусной кислоты.
В приемный стаканчик вносят 20 мл дистиллированной воды, 2 мл 0,01 н. раствора йода, 2 мл 10%-ного раствора едкого натра, ставят его под холодильник перегонного аппарата. В перегонную колбу вносят 10 мл фильтрата крови, 1 мл 20%-ного раствора серной кислоты и 15 мл дистиллированной воды. Параллельно готовят два контроля: в перегонную колбу вносят 25 мл дистиллированной воды и 1 мл 20%-ного раствора серной кислоты. Закрывают систему, включают электроплитки и кипятят контроль 15 мин, опытные образцы — 25 мин.
Последующий ход анализа такой же, как и при определении общего количества кетоновых тел. Расчет ведут по формуле
X мг% = ( А – В ) × 10,24,
где А — количество миллилитров 0,01 н. раствора гипосульфита, пошедшего на связывание свободного йода в контроле; В — количество миллилитров 0,01 н. раствора гипосульфита, пошедшего на связывание свободного йода в опыте; 10,24 — коэффициент для перевода в мг% в условиях данной реакции. 1 мл 0,01 н. раствора йода соответствует 0,1024 мг ацетона. Количество фильтрата в опыте соответствует 1 мл крови, поэтому связанное количество йода, умноженное на 10,24 (0,1024 × 100), будет соответствовать содержанию ацетона и ацетоуксусной кислоты в 100 мл крови.
Г. Определение β -оксимасляной кислоты.
В приемный стаканчик вносят те же реактивы, что и для определения общего количества кетоновых тел, ставят его под холодильник. Перегонную колбу после отгонки ацетона и ацетоуксусной кислоты охлаждают и вносят в нее
15 мл бихроматной смеси (не сразу, а в четыре приема). Закрывают систему, подключают электроплитки. Кипятят 28 мин. Необходимо следить, чтобы кипячение в колбе не прекращалось и жидкость не выкипала (не было потемнения бихромата). Если бихромат из воронки весь вылит, а жидкость выкипает, то можно частями долить дистиллированной воды. По истечении 28 мин отсоединяют от холодильника приемную колбу, отключают нагрев. Перегонную колбу и холодильник промывают 4–5 мл дистиллированной воды. Приемный стаканчик ставят в темное место на 15 мин.
Контроль: в перегонную колбу вносят 10 мл дистиллированной воды, 15 мл бихромата. Кипячение продолжается 25 мин. Титруют 0,01 н. раствором гипосульфата, как описано выше.
Расчет ведут по формуле
Х мг% = ( А – В ) × 25,
где А — количество 0,01 н. раствора гипосульфита, пошедшего на связывание свободного йода в контроле; В — количество 0,01 н. раствора гипосульфита, пошедшего на связывание свободного йода в опыте; 25 — коэффициенты для перевода в мг%.
Примечание. В лаборатории, где проводят определение кетоновых тел, должен быть чистый и свежий воздух. В этих условиях количество 0,01 н. раствора гипосульфита, пошедшего на титрование контрольных проб, должно быть только на 0,1–0,15 мл меньше, чем было затрачено при установлении титра 0,01 н. раствора йода, то есть на 2 мл должно пойти не менее 1,85–1,90 мл.
Проверяют чистоту воздуха следующим образом. Рядом с перегонным аппаратом ставят приемный стаканчик, в который внесено 5 мл дистиллированной воды, 2 мл 10%-ного раствора едкого натра и 2 мл 0,01 н. раствора йода. Смеси дают постоять 20–30 мин, после чего приливают 2 мл 20%-ного раствора серной кислоты, 2–3 капли раствора крахмала и титруют 0,01 н. раствором гипосульфита. Если в лаборатории воздух чистый, то на титрование пойдет около 1,9– 1,85 мл раствора гипосульфита, при его загрязнении — значительно меньше.
4.4.2. Экспресс-метод обнаружения ацетоновых тел в сыворотке (плазме) крови, моче, молоке
При содержании в сыворотке крови ацетона, ацетоуксусной кислоты в концентрации выше 10 мг/100 мл, что бывает при кетозе, их можно обнаружить с использованием специальных тест-пластин или реактива Лестраде, Ланге и др.
Состав реактива Лестраде:
Натрия нитропруссидного [Na2(Fe(NO)(CN)5 × 2Н2О] 1 часть, аммония сульфата [(NH4)2SO4] 20 частей, натрия карбоната безводного [Na2CO3] 20 частей. Компоненты мелко измельчают в фарфоровой ступке в однородный порошок, который помещают в склянку из темного стекла с пробкой. Хранят 1– 2 мес.
Ход определения. На фильтровальную бумагу на кончике скальпеля наносят около 100 мг реактива Лестраде и смачивают его 2–3 каплями сыворотки (плазмы) крови. Через 40–60 с считают реакцию. Появление сиреневой окраски
