- Смесь ледяной уксусной кислоты, уксусного ангидрида и концентрированной серной кислоты (1:5:1). Готовят, как описано выше (см. определение содержания общего холестерина в сыворотке крови).
Оборудование: центрифужные пробирки; пробирки с притертыми пробками на 10 мл; пипетки на 0,1, 1 и 5 мл; штатив для пробирок; водяная баня; центрифуга; ФЭК или спектрофотометр.
Ход определения. 0,1 мл сыворотки (плазмы) крови вносят в центрифужную пробирку, содержащую 5 мл ЭС, тщательно перемешивают стеклянной палочкой и оставляют стоять на 5–10 мин при использовании хлороформметаноловой смеси или на 1 ч при использовании спиртово-эфирной смеси. Затем центрифугируют в течение 10–15 мин при 2000–3000 об/мин. Центрифугат осторожно сливают в пробирку с притертой пробкой и ставят в водяную баню для выпаривания (не досуха, оставляют 0,5–1 мл центрифугата). Прибавляют 1 мл раствора дигитонина и перемешивают. Образуется белый налет — комплекс свободного холестерина с дигитонином. Оставляют стоять на 2–3 ч (или на ночь), после чего выпаривают досуха. После охлаждения в пробирку добавляют 5 мл хлороформа, тщательно взбалтывают. Хлороформенный экстракт фильтруют через обезжиренный бумажный фильтр или сливают после центрифугирования и используют для цветной реакции. С этой целью экстракт упаривают до минимума, добавляют 2 мл реактива 3, ставят в темное место на 20 мин, после чего колориметрируют. Хлороформ извлекает эфир холестерина, но не растворяет ни дигитонин-холестериновый комплекс, ни избыточный дигитонин.
Расчет ведут по калибровочной прямой, составленной для общего холестерина (см. определение содержания общего холестерина в сыворотке крови). По разности между общим и связанным находят количество свободного холестерина.
Клиническое значение. В норме доля эфирносвязанного холестерина в сыворотке крови животных достигает 70–90, у птиц — 60–70%. В результате все изменения его содержания отражают главным образом состояние печени и поджелудочной железы, где синтезируется эта фракция. Снижение данной фракции часто является следствием поражения синтетической функции печени и (или) поджелудочной железы.
4.5.8. Определение содержания β -липопротеидов в сыворотке (плазме) крови (по Бурштейну в модификации Виноградовой)
Липопротеиды (ЛП) сыворотки крови играют важную роль в жизнедеятельности организма. Они обеспечивают транспорт липидов как экзогенного (кормового) происхождения, так и синтезированных в печени и стенке тонкого кишечника (т. е. эндогенного происхождения) в систему циркуляции и далее к местам утилизации или депонирования; входят в состав клеточных мембран и ферментов; обезвреживают токсины; влияют на функцию свертывания крови и т. д.
Важнейшей физиологической функцией отдельных ЛП (α-ЛП) является удаление избытка свободного холестерина из клеток периферических тканей и обратный транспорт их в печень, где он окисляется в желчные кислоты и с желчью через кишечник выводится из организма. Наконец, ЛП осуществляет транспорт жирорастворимых витаминов, в том числе обладающих антиоксидантной активностью (α- и γ-токоферол, α- и β -каротин, убихинон и др.), а также стероидные гормоны и другие БАВ.
ЛП представляют собой водорастворимые комплексы, состоящие из липидной — холестерина (ХС), триацилглицерина (ТГ), фосфолипидной (ФЛ) и белковой части — аполипопротеида (АПО). Соотношение белок/липид может колебаться в широких пределах. И чем больше размер ЛП, тем больше в ней липидная часть, значит, меньше относительная плотность и меньше подвижность при электрофорезе.
Структура ЛП-комплекса, его липидный состав и обмен во многом определяются природой АПО, который активирует или тормозит соответствующие ферменты.
На основе неодинаковой относительной плотности при центрифугировании в растворах разной плотности или подвижности при электрофорезе в сыворотке крови млекопитающих различают четыре класса ЛП (табл. 4.4): хиломикроны (ХМ) — самый крупный по величине и самый легкий по относительной плотности класс. При центрифугировании флотирует по поверхности (d < < 1,006), второй класс — ЛП очень низкой плотности (ЛПОНП, d = 1,006– 1,019) или пре- β -ЛП. Затем идут ЛП низкой плотности (ЛПНП, d = 1,006–1,063) или β -ЛП и ЛП высокой плотности (ЛПВП, d = 1,063–1,21), или α-ЛП.
При электрофорезе ХМ остаются на старте, подобно γ-глобулинам, ЛПОНП, ЛПНП и ЛПВП занимают положение β , α1- и α2-глобулинов соответственно. У птиц в сыворотке крови содержится только три класса ЛП, ХМ у них не обнаружены. Как видно из таблицы 4.4, ХМ и ЛПОНП переносят в крови преимущественно ТГ, ЛПОНП — ХС и ЭХ, ЛПВП — ФЛ и ХЭ.
Таблица 4.4
Состав и свойства липопротеидов
| Класс | Плотность, г/мл | Диаметр частицы, нм | Приблизитель- ная молекуляр- ная масса, ×106 | Состав, % | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| ФЛ | ТГ | ХС | ЭХ | Белок | ||||
| ХМ | 0,95–1,006 | 200–500 | 103–104 | 5–10 | 80 | 10 | 7 | 2 |
| ЛПОНП | 0,99–1,006 | 20–70 | 5–100 | 20 | 55 | 13 | 5 | 10 |
| ЛПНП | 1,006–1,063 | — | 2–3 | 22 | 11 | 45 | 37 | 21 |
| ЛПВП | 1,063–1,21 | — | 0,25 | 26 | 6 | 18 | 15 | 50 |
С изменением физиологического состояния организма животных меняется и роль отдельных классов ЛП в обмене липидов. Так, отмечено повышение концентрации ЛПОНП в сыворотке крови высокопродуктивных и жирномолочных коров, а у кур — в период пика яйцекладки.
В лабораторной практике из-за отсутствия доступных методов исследований роль ЛП в обмене веществ оценивают главным образом по сумме β -липопротеидов (ЛПОНП + ЛПНП).
Принцип. В основе метода лежит реакция избирательного осаждения β -липопротеидов декстрина сульфатом или гепарином в присутствии двухвалентных катионов.
Реактивы.
-
1,025 моль/л раствор МnСl ~~2~~ .
-
1%-ный раствор гепарина (1 мл должен содержать 1000 ME; имеющийся в продаже гепарин, содержащий 25 000 ME в 5 мл, разводят дистиллированной водой 1:4).
Оборудование: ФЭК или спектрофотометр; пробирки; штатив для пробирок; стеклянные палочки; пипетки.
Ход определения. 2 мл 0,025 моль/л раствора МnСI2 вносят в пробирку и прибавляют 0,2 мл сыворотки крови, перемешивают и определяют оптическую плотность пробы ( Е 1) на ФЭКе в кювете с толщиной слоя 0,5 см при длине волны 700–720 нм (красный светофильтр) против воды. Затем в кювету добавляют 0,04 мл 1%-ного раствора гепарина. Пробы тщательно перемешивают стеклянной палочкой и строго через 10 мин повторяют фотометрирование ( Е 2). Разница Е 2– Е 1 приходится на оптическую плотность, обусловленную осадком β -липопротеидов. Умножая ее на коэффициент 1164 (определен расчетным способом), получают количество β -липопротеидов в сыворотке крови в мг%.
Примечание. Кровь берут натощак. Сыворотка сохраняется 2 сут.
Клиническое значение. Основная часть липидов сыворотки крови представлена в виде гидрофильных комплексов α- и β -липопротеидов. На долю β -липопротеидов приходится 60–70% всех липидов сыворотки крови. Печень является не только местом синтеза, но и активного катаболизма ЛП, а следовательно, и выведения из организма продуктов обмена липидов (холестерина). Поэтому определение их концентрации имеет важное клинико-физиологическое значение.
Повышение концентрации β -липопротеидов в сыворотке крови отмечается при скармливании высокожировых кормов, при острых гепатитах, диабете, ожирении, гипотериозе, желтухах; снижение — чаще всего при длительном дефиците в рационе белка (протеина) или незаменимых липотропных аминокислот, когда нарушается синтез апопротеида.
