(опыт и контроль) и добавляют по 0,5 мл раствора ДФК, перемешивают и оставляют стоять в темном месте. Через 15 мин развивается розово-малиновая окраска, интенсивность которой измеряют на ФЭКе или спектрофотометре при длине волны 550 нм против воды.
Расчет ведут по формуле
Х = ( А/В ) × 120,
где Х — содержание НЭЖК, мкмоль/л; А — показатель пробы, мкмоль/л; В — показатель стандарта, мкмоль/л; 120 — постоянный коэффициент.
Перед расчетом из показаний экстракции стандартной пробы (0,010 мкмоль) следует вычесть показания экстинкции слепой пробы. Расчет можно проводить и по калибровочному графику, который строят с использованием раствора пальмитиновой кислоты в пределах 0,005– 0,025 мкмоль/л.
Клиническое значение. Концентрация НЭЖК в сыворотке крови тесно связана с энергетической обеспеченностью организма животных и характеризует активность процессов мобилизации их из жировых депо. Поэтому при недостаточном поступлении энергии в организм, особенно в период раздоя, у самок птиц перед началом яйцекладки и в других случаях концентрация НЭЖК в сыворотке крови соответственно возрастает в 5–10 раз и более. Часто это предшествует параллельному увеличению концентрации кетоновых тел в крови.
Кратковременное повышение концентрации НЭЖК в сыворотке крови может быть результатом кормления по рационам, обогащенным кормовыми жирами; под влиянием инъекций адреналина; под воздействием стрессовых ситуаций; при сахарном диабете, ожирении, кетозе.
Снижается концентрация НЭЖК при введении глюкозы и инсулина.
4.5.6. Определение содержания общего холестерина в сыворотке крови
Принцип. В основу метода положена модифицированная Ильком реакция Любермана — Бурхарда, которая дает изумрудно-зеленое окрашивание в присутствии холестерина и смеси ледяной уксусной кислоты, уксусного ангидрида и концентрированной серной кислоты. Данный метод позволяет определять содержание холестерина без предварительной экстракции липидов из сыворотки крови.
Реактивы.
-
Смесь ледяной уксусной кислоты, уксусного ангидрида и концентрированной серной кислоты (1:5:1). При смешивании ингредиентов следует избегать нагревания смеси. Для этого колбу, в которой готовят реактив, помещают в сосуд со льдом, а серную кислоту добавляют в последнюю очередь медленно по каплям, постоянно помешивая. Смесь должна быть бесцветной или слегка желтого цвета и сохраняться в холодильнике.
-
Стандартный раствор холестерина: 100 мг холестерина в 100 мл хлороформа.
Оборудование: ФЭК или спектрофотометр; термостат; пробирки; штатив для пробирок; пипетки мерные на 0,1 и 5 мл.
Ход определения. К 2 мл реактива 1 добавляют 0,1 мл негемолизированной сыворотки, встряхивают короткими энергичными движениями и помещают в термостат на 20 мин при 37°С. Окрашенную в зеленый цвет жидкость колориметрируют на спектрофотометре (длина волны 650–660 нм) или на ФЭКе (красный светофильтр) в кюветах диаметром 0,5 см против контрольной пробы на реактивы (вместо сыворотки вносят 0,1 мл воды).
Расчет ведут по предварительно составленному калибровочному графику. Рабочий раствор холестерина готовят разведением стандартного в 10 раз (10 мл стандартного раствора + 90 мл хлороформа). 1 мл рабочего раствора содержит 0,1 мг холестерина. Затем в пробирки вносят по 0,1; 0,25; 0,50; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 и 3 мл рабочего раствора, что соответствует 0,025; 0,05; 0,10; 0,20; 0,25 и 0,30 мг холестерина. В седьмую пробирку вносят 1 мл хлороформа. Пробирки помещают в водяную баню для выпаривания досуха хлороформа; добавляют в них по 2 мл реактива 1 и далее поступают так как описано выше.
При постановке реакции используют абсолютно чистые и совершенно сухие пипетки и пробирки. Соотношение ингредиентов реактива рассчитано так, что белки сыворотки не выпадают в осадок. Появление мути может быть вызвано только наличием воды в реактиве или посуде.
При исследовании холестерина в экстракте липидов его вносят в пробирку в объеме, содержащем не более 1–5 мг чистых липидов.
Клиническое значение. Холестерин в сыворотке крови животных находится в двух формах: свободной (1/3) и эфирносвязанной с различными жирными кислотами (2/3). С возрастом концентрация холестерина возрастает. Гиперхолестеринемия отмечается при диабете, нефрозах, пониженной функции щитовидной железы; в начале голодания; у свиней и птицы — при скармливании рационов, обогащенных твердыми кормовыми жирами. При острых гепатитах уровень общего холестерина в начале заболевания обычно повышается, а затем падает ниже нормы. Для заболевания печени характерно падение эфирной фракции холестерина. Острое падение этой фракции в крови — плохой прогностический признак, указывающий на острую желтую атрофию печени или ее острое отравление.
4.5.7. Определение содержания этерифицированного холестерина в сыворотке крови (по Балаховскому)
Принцип. Метод основан на связывании свободного холестерина дигитонином (благодаря чему образуется нерастворимое в хлороформе соединение) и растворении хлороформом эфирносвязанного холестерина. Хлороформенный экстракт, содержащий эфирносвязанный холестерин, используется для цветной реакции с реактивом Илька (или с другим специфическим реактивом).
Реактивы.
-
Экстрагирующая смесь (ЭС: хлороформ-метанол 2:1 или этанол-эфир 3:1).
-
1%-ный спиртовой раствор дигитонина. 1 г дигитонина растворяют в 50 мл этилового спирта и доводят до 100 мл дистиллированной водой с подогревом.
- Смесь ледяной уксусной кислоты, уксусного ангидрида и концентрированной серной кислоты (1:5:1). Готовят, как описано выше (см. определение содержания общего холестерина в сыворотке крови).
Оборудование: центрифужные пробирки; пробирки с притертыми пробками на 10 мл; пипетки на 0,1, 1 и 5 мл; штатив для пробирок; водяная баня; центрифуга; ФЭК или спектрофотометр.
Ход определения. 0,1 мл сыворотки (плазмы) крови вносят в центрифужную пробирку, содержащую 5 мл ЭС, тщательно перемешивают стеклянной палочкой и оставляют стоять на 5–10 мин при использовании хлороформметаноловой смеси или на 1 ч при использовании спиртово-эфирной смеси. Затем центрифугируют в течение 10–15 мин при 2000–3000 об/мин. Центрифугат осторожно сливают в пробирку с притертой пробкой и ставят в водяную баню для выпаривания (не досуха, оставляют 0,5–1 мл центрифугата). Прибавляют 1 мл раствора дигитонина и перемешивают. Образуется белый налет — комплекс свободного холестерина с дигитонином. Оставляют стоять на 2–3 ч (или на ночь), после чего выпаривают досуха. После охлаждения в пробирку добавляют 5 мл хлороформа, тщательно взбалтывают. Хлороформенный экстракт фильтруют через обезжиренный бумажный фильтр или сливают после центрифугирования и используют для цветной реакции. С этой целью экстракт упаривают до минимума, добавляют 2 мл реактива 3, ставят в темное место на 20 мин, после чего колориметрируют. Хлороформ извлекает эфир холестерина, но не растворяет ни дигитонин-холестериновый комплекс, ни избыточный дигитонин.
Расчет ведут по калибровочной прямой, составленной для общего холестерина (см. определение содержания общего холестерина в сыворотке крови). По разности между общим и связанным находят количество свободного холестерина.
Клиническое значение. В норме доля эфирносвязанного холестерина в сыворотке крови животных достигает 70–90, у птиц — 60–70%. В результате все изменения его содержания отражают главным образом состояние печени и поджелудочной железы, где синтезируется эта фракция. Снижение данной фракции часто является следствием поражения синтетической функции печени и (или) поджелудочной железы.
4.5.8. Определение содержания β -липопротеидов в сыворотке (плазме) крови (по Бурштейну в модификации Виноградовой)
Липопротеиды (ЛП) сыворотки крови играют важную роль в жизнедеятельности организма. Они обеспечивают транспорт липидов как экзогенного (кормового) происхождения, так и синтезированных в печени и стенке тонкого кишечника (т. е. эндогенного происхождения) в систему циркуляции и далее к местам утилизации или депонирования; входят в состав клеточных мембран и ферментов; обезвреживают токсины; влияют на функцию свертывания крови и т. д.
