Кетоз коров и телят

1. Спиртовой раствор калия гидроксида (KОН). 2 г KОН растворяют в минимальном количестве дистиллированной воды и объем доводят 95%-ным этиловым спиртом до 100 мл (основной раствор). Для приготовления рабочего раствора 10 мл основного раствора доводят 95%-ным этиловым спиртом до 50 мл (готовят в день применения).

2. 0,1 моль/л раствор серной кислоты.

3. 0,05 моль/л раствор метперйодата (NaIO ~~4~~ ).

4. 0,5 моль/л раствор натрия арсенита (NaAsO ~~2~~ ).

5. Ацетил-ацетоновый реактив, рН 6,0 при 25°С.

150 г аммония ацетата, 3 мл ледяной уксусной кислоты и 2 мл ацетилацетонового реактива растворяют в 1 л дистиллированной воды. Реактив стоек в течение 2 недель при хранении в холодильнике.

1. 1%-ный стандартный раствор триацилглицеринов.

2. 1 триолеина или оливкового масла растворяют в 100 мл хлороформа.

3. Хранят в холодильнике, раствор стоек 2 месяца.

Оборудование: спектрофотометр или ФЭК; водяная баня; пробирки обычные и центрифужные с делением; колбочки или пробирки на 10 мл; делительные воронки на 25 и 50 мл.

Ход определения. 0,1 мл сыворотки (плазмы) вносят в колбочку, заливают экстрагирующей смесью и тщательно перемешивают. Через 2–3 мин содержимое пропускают через обезжиренный бумажный фильтр в мерную колбочку, доводят объем экстрагирующей смесью до 10 мл. В делительную воронку на 25 мл вносят 8 мл дистиллированной воды и 8 мл фильтрата (что соответствует 0,08 мл сыворотки). Содержимое хорошо перемешивают, отстаивают и нижний слой пропускают через стеклянную колонку размером 0,8 × 16 см (для задержки фосфолипидов), приготовленную следующим путем: в центрифужную пробирку со спиленным дном помещают кусочек стеклянной ваты и 0,5 г активированной кремовой кислоты. Перед использованием колонку промывают 5 мл хлороформа. Фильтрат пробы собирают в мерную колбочку на 10 мл или пробирку с делениями. Колонку промывают хлороформом, который также собирают в колбочку. Объем доводят хлороформом до метки. Затем в 3 пробирки вносят по 3 мл фильтрата (что соответствует 0,024 мл сыворотки или плазмы) и после выпаривания растворителя в водяной бане в первые две пробирки добавляют по 0,5 мл спиртового раствора KОН (омыляемые пробы), а в третью — 0,5 мл спирта (неомыляемая проба). Пробирки инкубируют в водяной бане 15 мин при 60°С. В конце инкубации в каждую из них добавляют по 0,5 мл 0,2 н. раствора серной кислоты, а затем по 0,1 мл 0,05 моль/л раствора метперйодата натрия (для окисления глицерина, освобожденного омылением).

Через 10 мин (ровно!) окисление приостанавливают добавлением по 0,1 мл 0,5 моль/л раствора натрия арсенита. Через 5–7 мин, когда испарится освободившийся йод, пробирки извлекают из бани и в них добавляют по 0,8 мл воды и по 2 мл ацетил-ацетонового реактива. Содержимое тщательно перемешивают перевертыванием пробирки и инкубируют в водяной бане при 58°С в течение 10 мин. Затем пробирки охлаждают до комнатной температуры и колориметрируют при длине волны 412 нм в кювете с толщиной слоя 0,5 см против

контроля. Степень поглощения омыляемой пробы минус степень поглощения неомыляемой пробы соответствует количеству триацилглицеринов, содержащихся в 0,24 мл исходного объема сыворотки (плазмы) крови. В используемом объеме сыворотки (плазмы) крови показания неомыляемых проб обычно очень малы и не имеют существенного значения.

Расчет ведут по формуле или калибровочному графику, который строят в пределах от 10 до 250 мкг/мл триацилглицеринов:

x = ( Е оп /Е ст) С ст,

где х — количество триацилглицеринов, мкг%; Е оп — экстинкция опытной пробы; Е ст — экстинкция стандартной пробы; С ст — концентрация триолеина в стандартном растворе, мг%.

Из основного раствора готовят серию рабочих калибровочных растворов (табл. 4.3).

Таблица 4.3

Приготовление рабочих калибровочных растворов

В пять опытных пробирок вносят по 1 мл каждого рабочего раствора и в шестую пробирку — 1 мл хлороформа для контроля на реактивы. Все пробирки помещают в кипящую баню на 10 мин для удаления хлороформа. Затем в них добавляют по 0,5 мл спиртового раствора калия гидроксида и процедуру продолжают, как описано выше.

Примечания.

1. Для анализа лучше использовать плазму крови, полученную на холоде, так как при получении сыворотки происходит частичный гидролиз триацилглицеринов.

2. В качестве антикоагулянта применяют ЭДТА натриевой или калиевой соли (1 мг на 1 мл крови). Гепарин применять не следует, так как он активирует липопротеидную липазу, гидролизирующую триацилглицерины.

Клиническое значение. Концентрация триацилглицеринов (нейтральных жиров) в сыворотке крови животных повышается при скармливании кормов, обогащенных жирами или богатых легкодоступными углеводами (картофель, зерно кукурузы, пшеницы и др.), активизирующих липогенез в печени (у моногастричных). Недостаток в рационах протеина и липотропных веществ (холина, метионина, треонина, селена, витамина Е, никотиновой кислоты и др.) также сопровождается нарастанием уровня нейтральных липидов в сыворотке крови животных. Увеличение концентрации триацилглицеринов отмечается при острых гепатитах, жировой дистрофии печени, нефрозах, диабете. Снижение их концентрации наблюдается при низком уровне кормления животных, усиленной молокоотдаче.

4.5.5. Определение содержания неэтерифицированных жирных кислот (НЭЖК) в сыворотке (плазме) крови (по Лауреллу и Тибблингу)

Принцип. Метод основан на образовании комплексных соединений НЭЖК с медью, которые с дифенилкарбазидом дают розово-малиновую окраску. По сравнению с другими он более чувствителен.

Реактивы.

1. Экстрагирующая смесь (ЭС) хлороформ-гептан 4:3 (по объему), содержащая 2% метанола.

2. Кремниевая кислота порошкообразная, предварительно активированная при 120°С 12 ч.

3. Меднотриэтаноламиновый реактив (Сu-ТЭА). 10 мл 0,5 моль/л раствора меди нитрата [Сu(NО3)2]: 10 мл 1 моль/л триэтаноламина (ТЭА) и 3,5 мл 1 моль/л натрия гидроксида растворяют в воде и доводят объем до 100 мл. В данном растворе растворяют 33 г NaCl, рН доводят до 8,1. Раствор готовят каждые 2 недели.

4. 4%-ный раствор дифенилкарбазида (ДФК) в этаноле. Готовят ежедневно. Непосредственно перед применением 0,1 мл 1 моль/л ТЭА добавляют к 10 мл 0,4%-ного раствора ДФК.

5. Стандартные растворы пальмитиновой кислоты (а. м. = 256,42) — 0,005 и 0,001 мкмоль/л. Для этого 25,642 мг пальмитиновой кислоты растворяют в 100 мл ЭС, получают 1 ммоль/л раствор. Затем 1 мл данного раствора доводят до 10 мл ЭС в мерной колбочке, получают 0,1 мкмоль/л. Далее из данного раствора путем разведения ЭС получают растворы с концентрацией 0,005 и 0,010 мкмоль/л пальмитиновой кислоты.

Оборудование: ФЭК или спектрофотометр; пробирки с притертыми пробками на 15–20 мл; центрифужные пробирки с притертой пробкой на 10 мл; встряхиватель. Стеклянную посуду, предназначенную для определения НЭЖК, выдерживают несколько часов в 1 моль/л растворе НСI и тщательно моют деминерализованной водой.

Ход определения. В пробирку с притертой пробкой вносят 250 мг активированной кремниевой кислоты с последующим внесением 9 мл ЭС и по 0,075 мл сыворотки (плазмы). Пробирки немедленно закрывают, закрепляют со штативом в горизонтальном положении на встряхивателе и встряхивают 10 мин, затем дают 15 мин постоять и вновь встряхивают 1–2 мин (можно вручную).

Одновременно готовят стандарт. Для этого в 3 пробирки вносят по 0,5 г кремниевой кислоты, далее в первую пробирку добавляют 9 мл ЭС, во вторую — 9 мл 0,005 мкмоль/л и в третью — 9 мл 0,010 мкмоль/л раствора пальмитиновой кислоты. Пробирки стандарта встряхивают вместе с пробами. Затем пробирки центрифугируют 10 мин при 2500–3000 об/мин и 5 мл верхней фазы переносят в пробирки с притертой пробкой, куда добавляют 2 мл раствора CuТЭА. Опять встряхивают и центрифугируют. После этого 3 мл верхней фазы (осторожно, не касаясь стенок и нижнего слоя) переносят в обычную пробирку