15 мл бихроматной смеси (не сразу, а в четыре приема). Закрывают систему, подключают электроплитки. Кипятят 28 мин. Необходимо следить, чтобы кипячение в колбе не прекращалось и жидкость не выкипала (не было потемнения бихромата). Если бихромат из воронки весь вылит, а жидкость выкипает, то можно частями долить дистиллированной воды. По истечении 28 мин отсоединяют от холодильника приемную колбу, отключают нагрев. Перегонную колбу и холодильник промывают 4–5 мл дистиллированной воды. Приемный стаканчик ставят в темное место на 15 мин.
Контроль: в перегонную колбу вносят 10 мл дистиллированной воды, 15 мл бихромата. Кипячение продолжается 25 мин. Титруют 0,01 н. раствором гипосульфата, как описано выше.
Расчет ведут по формуле
Х мг% = ( А – В ) × 25,
где А — количество 0,01 н. раствора гипосульфита, пошедшего на связывание свободного йода в контроле; В — количество 0,01 н. раствора гипосульфита, пошедшего на связывание свободного йода в опыте; 25 — коэффициенты для перевода в мг%.
Примечание. В лаборатории, где проводят определение кетоновых тел, должен быть чистый и свежий воздух. В этих условиях количество 0,01 н. раствора гипосульфита, пошедшего на титрование контрольных проб, должно быть только на 0,1–0,15 мл меньше, чем было затрачено при установлении титра 0,01 н. раствора йода, то есть на 2 мл должно пойти не менее 1,85–1,90 мл.
Проверяют чистоту воздуха следующим образом. Рядом с перегонным аппаратом ставят приемный стаканчик, в который внесено 5 мл дистиллированной воды, 2 мл 10%-ного раствора едкого натра и 2 мл 0,01 н. раствора йода. Смеси дают постоять 20–30 мин, после чего приливают 2 мл 20%-ного раствора серной кислоты, 2–3 капли раствора крахмала и титруют 0,01 н. раствором гипосульфита. Если в лаборатории воздух чистый, то на титрование пойдет около 1,9– 1,85 мл раствора гипосульфита, при его загрязнении — значительно меньше.
4.4.2. Экспресс-метод обнаружения ацетоновых тел в сыворотке (плазме) крови, моче, молоке
При содержании в сыворотке крови ацетона, ацетоуксусной кислоты в концентрации выше 10 мг/100 мл, что бывает при кетозе, их можно обнаружить с использованием специальных тест-пластин или реактива Лестраде, Ланге и др.
Состав реактива Лестраде:
Натрия нитропруссидного [Na2(Fe(NO)(CN)5 × 2Н2О] 1 часть, аммония сульфата [(NH4)2SO4] 20 частей, натрия карбоната безводного [Na2CO3] 20 частей. Компоненты мелко измельчают в фарфоровой ступке в однородный порошок, который помещают в склянку из темного стекла с пробкой. Хранят 1– 2 мес.
Ход определения. На фильтровальную бумагу на кончике скальпеля наносят около 100 мг реактива Лестраде и смачивают его 2–3 каплями сыворотки (плазмы) крови. Через 40–60 с считают реакцию. Появление сиреневой окраски
свидетельствует о наличии в сыворотке крови более 10 мг/100 мл (10 мг%) ацетона и ацетоуксусной кислоты (такова степень чувствительности реактива). Чем интенсивнее окраска, тем больше ацетоновых тел в исследуемой жидкости.
Если интенсивное фиолетовое окрашивание возникает немедленно, это свидетельствует о наличии в пробе 50–80 мг% и более АсАс. При появлении интенсивной фиолетовой окраски через 1 мин в пробе содержится 30–50 мг% АсАс, слабая голубая окраска после 3 мин — 10–30 мг% АсАс.
Полуколичественное определение кетоновых тел в сыворотке крови.
С этой целью сыворотку разводят дистиллированной водой. При содержании АсАс 30–50 мг% делают разведение 1:3, 1:4, 1:5, 1:6. В пробе с наибольшим разведением, дающим положительную реакцию, содержится 10 мг% АсАс. Умножая результат на разведение сыворотки, получаем содержание АсАс в неразведенной пробе.
Например, получена положительная проба сыворотки 1:4 и отрицательная при разведении 1:5 и 1:6. Значит, 10 мг% × 4 = 40 мг% АсАс в исследуемой пробе сыворотки крови.
Определение кетоновых тел в свежеполученных моче и молоке делается так же, как и в сыворотке крови.
Следует помнить, что экспресс-методы определения кетоновых тел чувствительны лишь к одной из их фракций (ацетону с ацетоуксусной кислотой), а соотношение фракций кетоновых тел в крови, моче молоке различно. В крови здоровых коров 70–90% приходится на фракцию ВН, в нормальном молоке она составляет 87–92% от ОКТ, с мочой в основном выделяется АсАс. В прокисшем молоке ацетоуксусная кислота легко превращается ацетон.
Определение фракции ВН в моче.
В стаканчик на 50 мл помещают 10 мл мочи, приливают к ней 10 мл дистиллированной воды и несколько капель уксусной кислоты. Упаривают под тягой жидкость в стакане до половины первоначального объема. При этом отгоняется ацетон и разрушается ацетоуксусная кислота, а бета-оксимасляная кислота остается неразрушенной. Дают жидкости остыть и переливают ее в пробирку. Прибавляют в пробирку 1 мл перекиси водорода, нагревают 1 мин и дают остыть. Бета-оксимасляная кислота окисляется в ацетоуксусную. Обнаруживают ее реактивом Лестраде.
4.5. Методы оценки состояния липидного обмена
4.5.1. Метод экстракции липидов хлороформ-метаноловой смесью (по Фолчу)
Принцип. Метод заключается в разрушении липидно-белковых связей полярными растворителями (в данном случае метанолом), что облегчает последующее экстрагирование липидов неполярными растворителями (хлороформом, диэтиловым или петролейным эфиром). В данном случае полярные и неполярные растворители представлены в виде одной смеси. Метод пригоден для извлечения липидов из любых тканей животного и растительного происхожде-
ния. В настоящее время считается универсальным. Обязательное требование данного метода — соблюдение соотношения субстрата и растворителя 1:20.
Реактивы.
-
Хлороформ. Из хлороформа необходимо удалить фосген, который реагирует с окси- и аминогруппами липидов. Свежий, имеющийся в продаже хлороформ достаточно перегнать и хранить в темной бутылке с добавлением 1% метанола (или этанола), который препятствует образованию фосгена.
-
Метанол освобождают от альдегидов перегонкой над гранулированным
калия гидроксидом. Перегнанный метанол хранят в темной бутылке 1–2 мес.
-
Смесь хлороформ-метанола в соотношении 2:1 по объему (смесь 1).
-
Смесь растворителей верхней фазы, содержащая минеральные соли (смесь 2): хлороформ-метанол-водный раствор соли в соотношении 3:48:47 по объему (т. е. отмерять каждый раствор в миллилитрах). В качестве солей могут быть использованы KСl (0,75%), NaCl (0,58%) или СаСl2 (0,04%).
-
Антиоксидант бутилокситолуол (БОТ, ионол).
Оборудование: пробирки обычные и с притертыми пробками вместимостью 10, 20 и 50 мл; цилиндры мерные с притертыми пробками вместимостью 25, 50 и 100 мл; конические колбочки с плоским дном обычные и с притертыми пробками на 50 и 100 мл; пипетки с делениями разных объемов; гомогенизатор; водоструйный насос; роторный испаритель; аналитические весы.
Ход определения. В пробирку или колбу наливают необходимое количество смеси 1, из пипетки вносят необходимый объем сыворотки (плазмы) крови или молока (например, 40 мл хлороформ-метаноловой смеси и 2 мл сыворотки в соотношении 1:20). Чтобы избежать окисления липидов, к пробам добавляют антиоксидант бутилокситолуол (БОТ), который вносят с метанолом в количестве 0,1% от количества липидов. Смесь тщательно перемешивают стеклянной палочкой или покачиванием колбы и оставляют стоять или подогревают на водяной бане при 40–45°С 2–3 мин, затем фильтруют через обезжиренный бумажный или стеклянный фильтр в мерный цилиндр на 50 мл с притертой пробкой.
Желток яйца вносят в предварительно взвешенную колбочку, взвешивают и заливают смесью 1.
Печень или мышечную ткань отвешивают, помещают в стакан гомогенизатора, добавляют такое же количество физраствора и гомогенизируют 2– 3 мин. Затем отвешивают необходимое количество (2–6 г) гомогената в плоскодонную колбочку, заливают 20 частями смеси 1, тщательно перемешивают стеклянной палочкой, оставляют стоять в течение 1 ч или подогревают на водяной бане в течение 5–10 мин и потом фильтруют в мерный цилиндр.
Для экстракции липидов из кормов или сухих образцов животных тканей их измельчают, заливают смесью 1, колбочки закрывают пробкой и оставляют для экстракции на 18–24 ч (с периодическим перемешиванием) или встряхивают на шугтель-аппарате в течение 1,5–2 ч. Содержимое подогревают при 45– 50°С 5–10 мин и фильтруют.
Для удаления нелипидных соединений из экстракта к последнему добавляют 1/5 объема воды (это соотношение следует строго соблюдать, так как в
