Кетоз коров и телят

тофосфорной кислоты. Механизм цветной реакции заключается в том, что ненасыщенные липиды реагируют с серной кислотой при нагревании с образованием карбониевого иона, взаимодействие которого с активированной карбоксильной группой ванилина фосфата образует стабильный комплекс. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию общих липидов в сыворотке крови.

Реактивы.

1. Серная кислота, концентрированная (х. ч.).

2. Ортофосфорная кислота, концентрированная (х. ч.).

3. Ванилин (х. ч.), 0,6%-ный раствор: 0,6 г ванилина растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды с нагреванием на водяной бане, после охлаждения доводят объем до 100 мл. Раствор стабилен при хранении при комнатной температуре.

4. Фосфор-ванилиновый реактив: 4 части ортофофорной кислоты смешивают с 1 частью 0,6%-ного раствора ванилина. Смесь хранят в темной склянке при комнатной температуре.

5. Хлороформ (х. ч. или для наркоза).

6. Стандартный раствор в хлороформе триолеина или холестерина (х. ч.) со свежим топленым и профильтрованным сливочным маслом в соотношении 1:3, или общие липиды, выделенные из сыворотки крови или печени. Взвешивают на аналитических весах в мерной колбе на 100 мл 1200 мг триолеина или другие указанные липиды и доводят хлороформом объем до метки. Хранят в темной склянке с притертой пробкой в холодильнике.

Оборудование: ФЭК или спектрофотометр; водяная баня; термостат; колбы мерные; пипетки; пробирки.

Ход определения. В пробирки (высотой 15 см) с 0,01 мл сыворотки крови добавляют 0,5 мл концентрированной серной кислоты. Содержимое пробирок тщательно перемешивают и ставят в кипящую водяную баню или термостат при температуре 130°С на 20 мин. Водяная баня должна быть заполнена водой не ниже уровня жидкости в пробирках, поставленных в нее. Используемые для анализа пробирки и другую посуду моют отдельно, тщательно ополаскивают дистиллированной водой и спиртом. Через 20 мин пробирки охлаждают под водопроводной водой, приливают 1,5 мл фосфор-ванилинового реактива, тщательно встряхивают и выдерживают в темноте при комнатной температуре 45 мин. Содержимое пробирки постепенно меняет желтый цвет на красный, который стабильно удерживается до 18 ч.

Через 1 ч определяют оптическую плотность на ФЭКе или спектрофотометре при зеленом фильтре (500–560 нм) в кювете с толщиной слоя 0,5–1 см против холостой пробы. Холостую пробу готовят так же, как и опытную, но вместо сыворотки берут 0,01 мл воды. Если концентрация липидов низкая и недостаточно улавливается на ФЭКе, то для исследования берут двойную дозу сыворотки (0,02 мл).

Расчет ведут по калибровочному графику. Для его построения из стандартного раствора триолеина готовят рабочие калибровочные растворы (табл. 4.1).

Приготовление рабочих растворов для построения калибровочного графика

Берут по 0,01 мл каждого разведения калибровочного раствора и выполняют те же операции, что и с опытными пробами (обязательно выдерживают в водяной бане точно так же, как и пробирки с исследуемой сывороткой). В противном случае цветная реакция с фосфор-ванилиновым реактивом не наступает или будет очень слабой, нехарактерной. Холостую пробу с дистиллированной водой можно не выдерживать в водяной бане.

На основании полученных данных строят калибровочный график.

Прямолинейная зависимость между концентрацией общих липидов и оптической плотностью сохраняется до 1200 мг%. Поэтому при большей концентрации сыворотку крови разводят физраствором и результаты умножают на разведение.

Для определения этим методом содержания общих липидов в тканях животных необходимо свежую или замороженную ткань подвергнуть десмолизу в 33%-ном растворе калия гидроксида. В пробирку помещают 200 или 300 мг ткани, прибавляют 3 мл 33%-ного калия гидроксида и выдерживают на кипящей водяной бане 60–120 мин, периодически встряхивая. Содержимое пробирок доводят дистиллированной водой до 5 мл и тщательно перемешивают. Из этого содержимого берут 0,2 мл в другую пробирку, приливают 1 мл серной кислоты и кипятят в бане или выдерживают в термостате при температуре 130°С в течение 20 мин. После охлаждения приливают 2 мл фосфорванилинового реактива и дальнейшие операции проводят так же, как описано выше с сывороткой крови. Однако в этом случае при исследовании на ФЭКе удобнее пользоваться кюветами с толщиной слоя 0,5 см.

Общие липиды — обобщенное понятие, включающие НЭЖК, триглицериды, фосфолипиды, свободный и эстерифицированный холестерин, сфингомиелины.

Физиологическая концентрация в сыворотке крови составляет 140– 550 мг%. Патологические изменения содержания липидов в крови происходят в основном в виде увеличения концентрации — гиперлипидемии, касаясь одного или группы липидов.

4.5.3. Определение содержания фосфолипидов (по Бартлетту – Ушеру)

Принцип. Метод основан на минерализации липидов с помощью хлорной кислоты. Неорганический фосфор, взаимодействуя с аммония молибдатом, об-

разует фосфомолибденовую кислоту, которую восстанавливают эйконогеном и натрия пиросульфитом в молибденовую синь. По степени окраски, определяемой колориметрически, вычисляют количество неорганического фосфора, содержащегося в фосфолипидах. Фосфолипиды стабильны в сыворотке или в плазме крови в течение 1 дня при комнатной температуре, 1 недели при хранении в холодильнике.

Реактивы.

1. Экстракционная смесь Фолча (хлороформ-метанол, 2:1).

2. 72%-ная хлорная кислота (НСIO ~~4~~ ) или смесь равных объемов 60%-ной хлорной и 95–97%-ной серной кислот (плотность 1,84).

3. 5%-ный раствор аммония молибдата [(NН4)6 × Мо7O24 × Н2О] (по объ-

ему).

1. Сульфит-сульфоновый реактив. 13 г пиросульфита натрия (Na2S2O5), 0,5 г сульфита натрия (Na2SO3) и 0,25 г эйконогена (1-амино-2-нафтол-4сульфоновая кислота) растворяют в 100 мл дистиллированной воды (перегнанной в стеклянном дистилляторе) при постоянном встряхивании в течение 1 ч. Фильтруют через бумажный фильтр (лучше через синтетический № 4) и хранят в темной склянке. Реактив готовят еженедельно.

Оборудование: ФЭК или спектрофотометр; песчаная баня; водяная баня; колбочки плоскодонные на 50 и 100 мл; воронки; пробирки с притертыми пробками и делениями на 10 мл; пипетки.

Ход определения. Для анализа берут 0,5 мл сыворотки крови, 0,5 г гомогената тканей или 0,2–0,4 г желтка и экстрагируют по методу Фолча. В две параллельные пробирки вносят экстракт липидов в объеме, соответствующем 0,1 мл сыворотки крови, 0,02 г тканей или 0,01 г яичного желтка, добавляют по 0,6 мл хлорной кислоты и ставят на песчаную баню для сжигания при 180^о С.

После просветления содержимого (через 1–1,5 ч) пробирки охлаждают и, тщательно перемешивая, последовательно добавляют следующие реактивы: по 4 мл дистиллированной воды, по 0,2 мл сульфит-сульфонового реактива и по 0,2 мл раствора аммония молибдата. Затем пробирки закрывают и помещают в водяную баню при 100°С на 10 мин. После охлаждения колориметрируют при длине волны 660 или 830 нм в кюветах с толщиной слоя 0,5–1 см против контрольной пробы (без липидов).

Расчет ведут по калибровочному графику, для построения которого используют двузамещенный фосфорнокислый калий (К2НРО4), высушенный до постоянной массы. 2,194 г реактива растворяют в 500 мл бидистиллированной воды. 1 мл раствора содержит 1 мг фосфора. Из основного раствора готовят рабочий раствор путем 50-кратного разведения водой (в 1 мл содержится 20 мкг фосфора). Если определение оптической плотности проводят на ФЭКе, то калибровочный график строят в пределах от 0,2 до 20 мкг, если же на спектрофотометре, то от 5 до 60 мкг фосфора (табл. 4.2).

Из каждого разведения берут по 2 мл калибровочного раствора, вносят в 2–3 параллельные пробирки и далее проделывают все операции, как описано выше. На основании полученных данных строят калибровочный график.