контроля. Степень поглощения омыляемой пробы минус степень поглощения неомыляемой пробы соответствует количеству триацилглицеринов, содержащихся в 0,24 мл исходного объема сыворотки (плазмы) крови. В используемом объеме сыворотки (плазмы) крови показания неомыляемых проб обычно очень малы и не имеют существенного значения.
Расчет ведут по формуле или калибровочному графику, который строят в пределах от 10 до 250 мкг/мл триацилглицеринов:
x = ( Е оп /Е ст) С ст,
где х — количество триацилглицеринов, мкг%; Е оп — экстинкция опытной пробы; Е ст — экстинкция стандартной пробы; С ст — концентрация триолеина в стандартном растворе, мг%.
Из основного раствора готовят серию рабочих калибровочных растворов (табл. 4.3).
Таблица 4.3
Приготовление рабочих калибровочных растворов
| № пробирки | Стандартный раствор, мл | Хлороформ, мл | Концентрация триацил- глицеринов, мкг/мл |
|---|---|---|---|
| 1 | 0,1 | 9,9 | 10 |
| 2 | 0,5 | 9,5 | 50 |
| 3 | 1,0 | 9,0 | 100 |
| 4 | 1,0 | 4,0 | 200 |
| 5 | 1,0 | 3,0 | 250 |
В пять опытных пробирок вносят по 1 мл каждого рабочего раствора и в шестую пробирку — 1 мл хлороформа для контроля на реактивы. Все пробирки помещают в кипящую баню на 10 мин для удаления хлороформа. Затем в них добавляют по 0,5 мл спиртового раствора калия гидроксида и процедуру продолжают, как описано выше.
Примечания.
-
Для анализа лучше использовать плазму крови, полученную на холоде, так как при получении сыворотки происходит частичный гидролиз триацилглицеринов.
-
В качестве антикоагулянта применяют ЭДТА натриевой или калиевой соли (1 мг на 1 мл крови). Гепарин применять не следует, так как он активирует липопротеидную липазу, гидролизирующую триацилглицерины.
Клиническое значение. Концентрация триацилглицеринов (нейтральных жиров) в сыворотке крови животных повышается при скармливании кормов, обогащенных жирами или богатых легкодоступными углеводами (картофель, зерно кукурузы, пшеницы и др.), активизирующих липогенез в печени (у моногастричных). Недостаток в рационах протеина и липотропных веществ (холина, метионина, треонина, селена, витамина Е, никотиновой кислоты и др.) также сопровождается нарастанием уровня нейтральных липидов в сыворотке крови животных. Увеличение концентрации триацилглицеринов отмечается при острых гепатитах, жировой дистрофии печени, нефрозах, диабете. Снижение их концентрации наблюдается при низком уровне кормления животных, усиленной молокоотдаче.
4.5.5. Определение содержания неэтерифицированных жирных кислот (НЭЖК) в сыворотке (плазме) крови (по Лауреллу и Тибблингу)
Принцип. Метод основан на образовании комплексных соединений НЭЖК с медью, которые с дифенилкарбазидом дают розово-малиновую окраску. По сравнению с другими он более чувствителен.
Реактивы.
-
Экстрагирующая смесь (ЭС) хлороформ-гептан 4:3 (по объему), содержащая 2% метанола.
-
Кремниевая кислота порошкообразная, предварительно активированная при 120°С 12 ч.
-
Меднотриэтаноламиновый реактив (Сu-ТЭА). 10 мл 0,5 моль/л раствора меди нитрата [Сu(NО3)2]: 10 мл 1 моль/л триэтаноламина (ТЭА) и 3,5 мл 1 моль/л натрия гидроксида растворяют в воде и доводят объем до 100 мл. В данном растворе растворяют 33 г NaCl, рН доводят до 8,1. Раствор готовят каждые 2 недели.
-
4%-ный раствор дифенилкарбазида (ДФК) в этаноле. Готовят ежедневно. Непосредственно перед применением 0,1 мл 1 моль/л ТЭА добавляют к 10 мл 0,4%-ного раствора ДФК.
-
Стандартные растворы пальмитиновой кислоты (а. м. = 256,42) — 0,005 и 0,001 мкмоль/л. Для этого 25,642 мг пальмитиновой кислоты растворяют в 100 мл ЭС, получают 1 ммоль/л раствор. Затем 1 мл данного раствора доводят до 10 мл ЭС в мерной колбочке, получают 0,1 мкмоль/л. Далее из данного раствора путем разведения ЭС получают растворы с концентрацией 0,005 и 0,010 мкмоль/л пальмитиновой кислоты.
Оборудование: ФЭК или спектрофотометр; пробирки с притертыми пробками на 15–20 мл; центрифужные пробирки с притертой пробкой на 10 мл; встряхиватель. Стеклянную посуду, предназначенную для определения НЭЖК, выдерживают несколько часов в 1 моль/л растворе НСI и тщательно моют деминерализованной водой.
Ход определения. В пробирку с притертой пробкой вносят 250 мг активированной кремниевой кислоты с последующим внесением 9 мл ЭС и по 0,075 мл сыворотки (плазмы). Пробирки немедленно закрывают, закрепляют со штативом в горизонтальном положении на встряхивателе и встряхивают 10 мин, затем дают 15 мин постоять и вновь встряхивают 1–2 мин (можно вручную).
Одновременно готовят стандарт. Для этого в 3 пробирки вносят по 0,5 г кремниевой кислоты, далее в первую пробирку добавляют 9 мл ЭС, во вторую — 9 мл 0,005 мкмоль/л и в третью — 9 мл 0,010 мкмоль/л раствора пальмитиновой кислоты. Пробирки стандарта встряхивают вместе с пробами. Затем пробирки центрифугируют 10 мин при 2500–3000 об/мин и 5 мл верхней фазы переносят в пробирки с притертой пробкой, куда добавляют 2 мл раствора CuТЭА. Опять встряхивают и центрифугируют. После этого 3 мл верхней фазы (осторожно, не касаясь стенок и нижнего слоя) переносят в обычную пробирку
(опыт и контроль) и добавляют по 0,5 мл раствора ДФК, перемешивают и оставляют стоять в темном месте. Через 15 мин развивается розово-малиновая окраска, интенсивность которой измеряют на ФЭКе или спектрофотометре при длине волны 550 нм против воды.
Расчет ведут по формуле
Х = ( А/В ) × 120,
где Х — содержание НЭЖК, мкмоль/л; А — показатель пробы, мкмоль/л; В — показатель стандарта, мкмоль/л; 120 — постоянный коэффициент.
Перед расчетом из показаний экстракции стандартной пробы (0,010 мкмоль) следует вычесть показания экстинкции слепой пробы. Расчет можно проводить и по калибровочному графику, который строят с использованием раствора пальмитиновой кислоты в пределах 0,005– 0,025 мкмоль/л.
Клиническое значение. Концентрация НЭЖК в сыворотке крови тесно связана с энергетической обеспеченностью организма животных и характеризует активность процессов мобилизации их из жировых депо. Поэтому при недостаточном поступлении энергии в организм, особенно в период раздоя, у самок птиц перед началом яйцекладки и в других случаях концентрация НЭЖК в сыворотке крови соответственно возрастает в 5–10 раз и более. Часто это предшествует параллельному увеличению концентрации кетоновых тел в крови.
Кратковременное повышение концентрации НЭЖК в сыворотке крови может быть результатом кормления по рационам, обогащенным кормовыми жирами; под влиянием инъекций адреналина; под воздействием стрессовых ситуаций; при сахарном диабете, ожирении, кетозе.
Снижается концентрация НЭЖК при введении глюкозы и инсулина.
4.5.6. Определение содержания общего холестерина в сыворотке крови
Принцип. В основу метода положена модифицированная Ильком реакция Любермана — Бурхарда, которая дает изумрудно-зеленое окрашивание в присутствии холестерина и смеси ледяной уксусной кислоты, уксусного ангидрида и концентрированной серной кислоты. Данный метод позволяет определять содержание холестерина без предварительной экстракции липидов из сыворотки крови.
Реактивы.
-
Смесь ледяной уксусной кислоты, уксусного ангидрида и концентрированной серной кислоты (1:5:1). При смешивании ингредиентов следует избегать нагревания смеси. Для этого колбу, в которой готовят реактив, помещают в сосуд со льдом, а серную кислоту добавляют в последнюю очередь медленно по каплям, постоянно помешивая. Смесь должна быть бесцветной или слегка желтого цвета и сохраняться в холодильнике.
-
Стандартный раствор холестерина: 100 мг холестерина в 100 мл хлороформа.
Оборудование: ФЭК или спектрофотометр; термостат; пробирки; штатив для пробирок; пипетки мерные на 0,1 и 5 мл.
