В приемный стаканчик вносят 20 мл дистиллированной воды, 2 мл 0,01 н. раствора йода, 2 мл 10%-ного раствора едкого натра и ставят под холодильник перегонного аппарата, чтобы конец его погрузился в жидкость. В перегонную колбу вносят 10 мл фильтрата крови, 15 мл бихроматной смеси и 10 мл дистиллированной воды. Параллельно готовят контроль в двух аппаратах: в перегонную колбу вносят 20 мл дистиллированной воды и 15 мл бихроматной смеси. Приборы закрывают, соединяют холодильники с водой и включают электроплитки. Опытные образцы кипятят 25 мин, контрольные — 15 мин. Отключают нагрев, снимают перегонную колбу, холодильник смывают небольшим количеством дистиллированной воды. Приемный стаканчик закрывают крышкой и ставят в темное место на 15–20 мин. По истечении указанного срока в приемный стаканчик быстро приливают 2 мл 20%-ного раствора серной кислоты, добавляют 2–3 капли 1%-ного раствора крахмала и титруют 0,01 н. раствором гипосульфита до обесцвечивания.
Расчет ведут по формуле
X мг% = ( А – В ) × 0,25 × 100,
где X — количество кетоновых тел в мг%; А — количество мл 0,01 н. раствора гипосульфата, пошедшего на титрование свободного йода в контрольной пробе; В — количество миллилитров 0,01 н. раствора гипосульфита, пошедшего на титрование свободного йода в опытной пробе; 1 мл 0,01 н. раствора йода связывает в данных условиях 0,25 мг ацетона; 100 — коэффициент перевода, мг%.
В. Определение ацетона и ацетоуксусной кислоты.
В приемный стаканчик вносят 20 мл дистиллированной воды, 2 мл 0,01 н. раствора йода, 2 мл 10%-ного раствора едкого натра, ставят его под холодильник перегонного аппарата. В перегонную колбу вносят 10 мл фильтрата крови, 1 мл 20%-ного раствора серной кислоты и 15 мл дистиллированной воды. Параллельно готовят два контроля: в перегонную колбу вносят 25 мл дистиллированной воды и 1 мл 20%-ного раствора серной кислоты. Закрывают систему, включают электроплитки и кипятят контроль 15 мин, опытные образцы — 25 мин.
Последующий ход анализа такой же, как и при определении общего количества кетоновых тел. Расчет ведут по формуле
X мг% = ( А – В ) × 10,24,
где А — количество миллилитров 0,01 н. раствора гипосульфита, пошедшего на связывание свободного йода в контроле; В — количество миллилитров 0,01 н. раствора гипосульфита, пошедшего на связывание свободного йода в опыте; 10,24 — коэффициент для перевода в мг% в условиях данной реакции. 1 мл 0,01 н. раствора йода соответствует 0,1024 мг ацетона. Количество фильтрата в опыте соответствует 1 мл крови, поэтому связанное количество йода, умноженное на 10,24 (0,1024 × 100), будет соответствовать содержанию ацетона и ацетоуксусной кислоты в 100 мл крови.
Г. Определение β -оксимасляной кислоты.
В приемный стаканчик вносят те же реактивы, что и для определения общего количества кетоновых тел, ставят его под холодильник. Перегонную колбу после отгонки ацетона и ацетоуксусной кислоты охлаждают и вносят в нее
15 мл бихроматной смеси (не сразу, а в четыре приема). Закрывают систему, подключают электроплитки. Кипятят 28 мин. Необходимо следить, чтобы кипячение в колбе не прекращалось и жидкость не выкипала (не было потемнения бихромата). Если бихромат из воронки весь вылит, а жидкость выкипает, то можно частями долить дистиллированной воды. По истечении 28 мин отсоединяют от холодильника приемную колбу, отключают нагрев. Перегонную колбу и холодильник промывают 4–5 мл дистиллированной воды. Приемный стаканчик ставят в темное место на 15 мин.
Контроль: в перегонную колбу вносят 10 мл дистиллированной воды, 15 мл бихромата. Кипячение продолжается 25 мин. Титруют 0,01 н. раствором гипосульфата, как описано выше.
Расчет ведут по формуле
Х мг% = ( А – В ) × 25,
где А — количество 0,01 н. раствора гипосульфита, пошедшего на связывание свободного йода в контроле; В — количество 0,01 н. раствора гипосульфита, пошедшего на связывание свободного йода в опыте; 25 — коэффициенты для перевода в мг%.
Примечание. В лаборатории, где проводят определение кетоновых тел, должен быть чистый и свежий воздух. В этих условиях количество 0,01 н. раствора гипосульфита, пошедшего на титрование контрольных проб, должно быть только на 0,1–0,15 мл меньше, чем было затрачено при установлении титра 0,01 н. раствора йода, то есть на 2 мл должно пойти не менее 1,85–1,90 мл.
Проверяют чистоту воздуха следующим образом. Рядом с перегонным аппаратом ставят приемный стаканчик, в который внесено 5 мл дистиллированной воды, 2 мл 10%-ного раствора едкого натра и 2 мл 0,01 н. раствора йода. Смеси дают постоять 20–30 мин, после чего приливают 2 мл 20%-ного раствора серной кислоты, 2–3 капли раствора крахмала и титруют 0,01 н. раствором гипосульфита. Если в лаборатории воздух чистый, то на титрование пойдет около 1,9– 1,85 мл раствора гипосульфита, при его загрязнении — значительно меньше.
4.4.2. Экспресс-метод обнаружения ацетоновых тел в сыворотке (плазме) крови, моче, молоке
При содержании в сыворотке крови ацетона, ацетоуксусной кислоты в концентрации выше 10 мг/100 мл, что бывает при кетозе, их можно обнаружить с использованием специальных тест-пластин или реактива Лестраде, Ланге и др.
Состав реактива Лестраде:
Натрия нитропруссидного [Na2(Fe(NO)(CN)5 × 2Н2О] 1 часть, аммония сульфата [(NH4)2SO4] 20 частей, натрия карбоната безводного [Na2CO3] 20 частей. Компоненты мелко измельчают в фарфоровой ступке в однородный порошок, который помещают в склянку из темного стекла с пробкой. Хранят 1– 2 мес.
Ход определения. На фильтровальную бумагу на кончике скальпеля наносят около 100 мг реактива Лестраде и смачивают его 2–3 каплями сыворотки (плазмы) крови. Через 40–60 с считают реакцию. Появление сиреневой окраски
свидетельствует о наличии в сыворотке крови более 10 мг/100 мл (10 мг%) ацетона и ацетоуксусной кислоты (такова степень чувствительности реактива). Чем интенсивнее окраска, тем больше ацетоновых тел в исследуемой жидкости.
Если интенсивное фиолетовое окрашивание возникает немедленно, это свидетельствует о наличии в пробе 50–80 мг% и более АсАс. При появлении интенсивной фиолетовой окраски через 1 мин в пробе содержится 30–50 мг% АсАс, слабая голубая окраска после 3 мин — 10–30 мг% АсАс.
Полуколичественное определение кетоновых тел в сыворотке крови.
С этой целью сыворотку разводят дистиллированной водой. При содержании АсАс 30–50 мг% делают разведение 1:3, 1:4, 1:5, 1:6. В пробе с наибольшим разведением, дающим положительную реакцию, содержится 10 мг% АсАс. Умножая результат на разведение сыворотки, получаем содержание АсАс в неразведенной пробе.
Например, получена положительная проба сыворотки 1:4 и отрицательная при разведении 1:5 и 1:6. Значит, 10 мг% × 4 = 40 мг% АсАс в исследуемой пробе сыворотки крови.
Определение кетоновых тел в свежеполученных моче и молоке делается так же, как и в сыворотке крови.
Следует помнить, что экспресс-методы определения кетоновых тел чувствительны лишь к одной из их фракций (ацетону с ацетоуксусной кислотой), а соотношение фракций кетоновых тел в крови, моче молоке различно. В крови здоровых коров 70–90% приходится на фракцию ВН, в нормальном молоке она составляет 87–92% от ОКТ, с мочой в основном выделяется АсАс. В прокисшем молоке ацетоуксусная кислота легко превращается ацетон.
Определение фракции ВН в моче.
В стаканчик на 50 мл помещают 10 мл мочи, приливают к ней 10 мл дистиллированной воды и несколько капель уксусной кислоты. Упаривают под тягой жидкость в стакане до половины первоначального объема. При этом отгоняется ацетон и разрушается ацетоуксусная кислота, а бета-оксимасляная кислота остается неразрушенной. Дают жидкости остыть и переливают ее в пробирку. Прибавляют в пробирку 1 мл перекиси водорода, нагревают 1 мин и дают остыть. Бета-оксимасляная кислота окисляется в ацетоуксусную. Обнаруживают ее реактивом Лестраде.
4.5. Методы оценки состояния липидного обмена
4.5.1. Метод экстракции липидов хлороформ-метаноловой смесью (по Фолчу)
Принцип. Метод заключается в разрушении липидно-белковых связей полярными растворителями (в данном случае метанолом), что облегчает последующее экстрагирование липидов неполярными растворителями (хлороформом, диэтиловым или петролейным эфиром). В данном случае полярные и неполярные растворители представлены в виде одной смеси. Метод пригоден для извлечения липидов из любых тканей животного и растительного происхожде-
