бластацисты (78,5%), на 8-й день на стадии экспондированной бластоцисты (73,8%), на девятый день 21,7% эмбрионов начали выходить из зоны, а 45,1% уже вышли из зоны. Процент отставших в развитии по этим срокам составило 30,1% 10,1% 7,5%; 5,7% на 6, 7, 8 и 9 день, соответственно. Из чего следует, что наиболее целесообразно проводить извлечение зародышей на 7-8 день, когда получаем наибольший выход эмбрионов пригодных к пересадке или криоконсервированию.
Таблица 42 - Стадия развития эмбрионов в зависимости от срока после осеменения
| Эмбрионы по стадиям, раз | Срок после осеменения | |||
|---|---|---|---|---|
| 6 | 7 | 8 | 9 | |
| 2-клеточные | 4,7 | 2,5 | 2,1 | 1,7 |
| 4-клеточные | 8,2 | 3,1 | 2,1 | 1,5 |
| 8-клеточные | 7,4 | 2,7 | 1,0 | 1,3 |
| 16-клеточные | 9,8 | 1,8 | 2,3 | 1,2 |
| Ранняя морула | 49,7 | 6,5 | 3,5 | 2,9 |
| Поздняя морула | 20,0 | 43,9 | 2,1 | 1,7 |
| Ранняя бластоциста | 0,2 | 34,6 | 11,8 | 2,8 |
| Экспондированная бластоциста | - | 4,8 | 73,8 | 10,3 |
| Вылупляющаяся бластоциста | - | 0,1 | 1,3 | 21,7 |
| Вылупившаяся бластосиста | - | - | - | 45,1 |
7.5.6. Оценка жизнеспособности эмбрионов методом культивирования
Одним из методов определения биологической полноценности эмбрионов является их культивирование вне организма (in vitro) /80/ в различных солевых растворах и синтетических питательных средах. В наших исследованиях мы использовали фосфатно-солевой буфер Дюльбекко, раствор Хенкса и питательную среду ТС-99 отечественного производства с добавлением 20% фетальной или эстральной сыворотки (табл. 43).
Как показал опыт (культивирование продолжалось 24 часа) наименьший уровень продолживших развитие эмбрионов был в случае, когда на культивирование ставились ранние морулы. Средний процент таких зародышей составил всего 66,0%. По мере увеличения возраста эмбриона увеличивалось и количество продолжавших свое развитие – 77,1% поздних морул 92,7% ранних и 100% поздних бластоцист. Кроме этого отмечено более эффективное действие на этот процесс сложных питательных сред. При использовании ТС-99 86,7% продолжили свое развитие, фосфатного буфера Дюльбекко и раствора Хенкса. Эти показатели составили 76,4 и 84,5%, соответственно. Следует также отменить более высокую эффективность использования эстральной сыворотки по сравнению с фетальной сывороткой плодов крупного рогатого скота.
Таблица 43 - Оценка качества эмбрионов методом культивирования
| Питательная среда | Стадия развития | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Мо I | Мо II | Бла I | Бла II | |||||
| Поставлено на культивирования, n | Продолжили развитие, n - % | Поставлено на культивирования, n | Продолжили развитие, n - % | Поставлено на культивирования, n | Продолжили развитие, n - % | Поставлено на культивирования, n | Продолжили развитие, n - % | |
| Дюльбекко + 20% ФС | 10 | 5-50,0 | 7 | 5-71,4 | 5 | 4-80,0 | 7 | 7-100 |
| Дюльбекко + 20% ФС | 7 | 4-57,1 | 5 | 4-80,0 | 5 | 4-80,0 | 9 | 9-100 |
| Хенкса + 20% ФС | 8 | 5-62,5 | 8 | 7-87,5 | 7 | 7-100 | 5 | 5-100 |
| Хенкса + 20% ФС | 9 | 6-66,7 | 8 | 6-75,0 | 7 | 7-100 | 6 | 6-100 |
| ТС-199 + 20% ФС | 8 | 6-75,0 | 11 | 8-72,7 | 9 | 8-88,9 | 7 | 7-100 |
| ТС-199 + 20% ФС | 8 | 7-87,5 | 9 | 7-77,8 | 8 | 8-100 | 7 | 7-100 |
| Итого | 50 | 33-66,0 | 48 | 37-77,1 | 41 | 38-92,7 | 41 | 41-100 |
Результаты культивирования половинок эмбрионов после деления (табл. 44) показывают схожие результаты, как по используемым средам, так и по сывороткам. Анализ данных регенеративной способности демиэмбрионов в зависимости от стадии, на которой находился интактный эмбрион, выявил, что наибольшей способностью к дальнейшей активизации и развитию обладают половинки поздних морул и ранних бластоцист, процент жизнеспособности которых составил 85,4% и 90,6%, в то время как среди поздних бластоцист развилось 40,5% полуэмбрионов, а среди ранних морул всего лишь 15,0%.
Таким образом, наиболее пригодными для деления являются эмбрионы на стадии поздней морулы и ранней бластоцисты.
Таблица 44 - Оценка качества половинных эмбрионов методом культивирования
| Питательная среда | Стадия развития | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Мо I | Мо II | Бла I | Бла II | |||||
| Поставлено на культивирования, n | Продолжили развитие, n - % | Поставлено на культивирования, n | Продолжили развитие, n - % | Поставлено на культивирования, n | Продолжили развитие, n - % | Поставлено на культивирования, n | Продолжили развитие, n - % | |
| Дюльбекко + 20% ФС | 5 | 1-20 | 4 | 3-75 | 6 | 6-100 | 7 | 4-57,1 |
| Дюльбекко + 20% ФС | 5 | - | 6 | 5-83,3 | 6 | 5-83,3 | 7 | 3-42,8 |
| Хенкса + 20% ФС | 7 | 1-14,3 | 7 | 7-100 | 8 | 5-62,5 | 6 | 2-33,3 |
| Хенкса + 20% ФС | 7 | 1-14,3 | 7 | 7-100 | 8 | 6-75,0 | 6 | 1-16,7 |
| ТС-199 + 20% ФС | 8 | 1-12,5 | 4 | 3-75 | 10 | 10-100 | 8 | 4-50 |
| ТС-199 + 20% ФС | 8 | 2-25 | 4 | 4-100 | 10 | 9-90,0 | 8 | 3-37,5 |
| Итого | 40 | 6-15,0 | 32 | 29-90,6 | 48 | 41-85,4 | 42 | 17-40,5 |
