зародыша, при этом осмотическое давление повышается и сюда начинает поступать жидкость. Накапливаясь между бластомерами, жидкость отодвигает бластомеры к одному из полюсов трофобласта, здесь из них формируется эмбриобласт. Плотные контакты, которыми соединяются клетки трофобласта помогают удержать жидкость в полости. Чем больше бластополость и лучше развита внутренняя клеточная масса и трофобласт – тем больше потенциал эмбриона к имплантации. Когда полость бластоцисты достигает значительного размера, источившаяся за счет растяжения зона пеллюцида разрывается и начинается процесс хэтчинга, т.е. выхода бластоцисты из зоны пеллюцида. Только после окончания этого процесса бластоциста способна имплантироваться в эндометрий матки.
7.1. Общие подходы к оценке качества клеток
Оценка состояния зародышей служит для отбора неоплодотворенных яйцеклеток и определения стадии развития эмбрионов, а также выявления повреждений отдельных бластомеров или всего эмбриона. Морфологическая оценка является основным методом определения качества клеток. При этом учитываются основные морфологические признаки полноценности зародышей, которые могут визуально наблюдаться у эмбриона, а именно: целостность и равномерность развития бластомеров, прозрачность перивителинового пространства, целостность зоны пеллюцида, соответствии стадии развития возрасту эмбриона. Частицы на поверхности зоны пеллюцида указывают на возможность бактериального заражения. Часто при инфицировании половых органов доноров яйцеклетки остаются неоплодотворенными. Различия в величине между бластомерами в пределах 2:1 оцениваются как нормальные, так как к исследованию попадают эмбрионы при различной последовательности циклов деления. Более сильные различия величины (4:1 и больше) возникают, если отдельные бластомеры прекращают деление. Сжатие бластомеров - это в большинстве случаев последствие
гипертонических нагрузок. Деформация возникает при измененном внутреннем давлении клеток, или в результате дефектов в клеточных мембранах. По результатам оценки делается заключение о качестве эмбриона и принимается решение о его дальнейшем использовании.
7.2. Временные параметры развития эмбрионов
Овуляция у нормально циклирующих коров происходит через 30-32 ч после начала течки. Оплодотворение ооцита полноценным спермием наступает уже через 3-4 ч после овуляции. Слияние пронуклеусов происходит через 15 ч. после оплодотворения. Оплодотворенные in vitro яйцеклетки коров достигают 2, 4 и 8-клеточной фазы в период между 15-24 ч, 3540 ч и через 45-50 ч после оплодотворения. Ранние и поздние морулы, а также ранние бластоцисты появляются через 120 часов. Через 8 суток в среде обнаруживаются поздние и экспандированные бластоцисты, через 264 часа (11 суток) – вышедшие из зоны пеллюцида.
7.3. Морфологическая оценка качества ооцитов in vitro
Использование технологии in vitro с достаточной эффективностью невозможно без определения способности половых клеток к полноценному созреванию и оплодотворению. Одним из классических способов определения жизнеспособности ооцитов считается оценка их морфологического состояния с использованием прижизненной микроскопии.
Популяция выделенных фолликулярных ооцитов является весьма неоднородной как по морфологии, так и по функциональному состоянию. У 30% всех яйцеклеток выявляются видимые признаки дегенерации: сжатие или фрагментация ооплазмы, увеличение перивителинового пространства, отслоение или полное отсутствие кумулюса;
деформированная, неравномерная по толщине прозрачная оболочка и др. Остальные клетки можно считать пригодными для культивирования, однако при цитогенетическом анализе ооцитов после 24 часов культивирования обнаруживается около 80% зрелых, пригодных к оплодотворению яйцеклеток.
В организме самки ооциты созревают в фолликуле. Тесная связь ооцита и окружающих его кумулюсных клеток обеспечивает его нормальное развитие и созревание.
По состоянию кумулюса яйцеклетки можно подразделить на следующие группы:
-
Ооциты с компактным, многослойным, плотно прилегающим к ооциту, кумулюсом.
-
Ооциты с разрыхленным многослойным кумулюсом.
-
Ооциты с разрыхленным, частично отслоившимся кумулюсом или в виде разрозненных участков, покрывающих ооцит.
Ооплазму у ооцита можно охарактеризовать по следующим признакам:
-
Мелкозернистая, равномерно заполняющая пространство под прозрачной оболочкой.
-
Ооплазма с участками гранулярной конденсации, равномерно заполняющая пространство под прозрачной оболочкой.
Прозрачная оболочка, обеспечивающая связь внутренних структур ооцита с внешней средой, характеризуется следующими данными: опалесцирующая, равномерная по ширине, округлой формы.
Из морфологической оценки качества вышеперечисленных структур слагается общая оценка качества ооцит кумулюсных комплексов и его способности к дальнейшему развитию и созреванию (табл. 40). Популяцию полученных ооцит–кумулюсных комплексов рекомендуется разделять на группы по следующим морфологическим признакам:
