11.2.2. Эффективность использования эстральной сыворотки в культуре in vitro
Несмотря на достаточно высокий уровень разработки данной проблемы эффективность получения биологически полноценных эмбрионов в системе in vitro остается на сравнительно невысоком уровне. По некоторым данным [6, 8], в лучших лабораториях мира выход качественных зародышей (стадия бластоцисты) не превышает 35-40% от числа поставленных на созревание ооцитов, а в среднем этот показатель колеблется от 10 до 20% и зависит от ряда экзо- и эндогенных факторов, к которым, в первую очередь, относится создание оптимального газового и влажносгаого режимов культивирования, а также обеспечение растущих и развивающихся клеток необходимыми гормональными и энергетическими добавками.
В связи с выше сказанным, целью наших исследований явилось определение эффективности использования сыворотки крови крупного рогатого скота в системе in vitro.
Для полноценного созревания ооцитов в культуре in vitro им необходимо создать условия максимально соответствующие естественным, то есть тем, в которых обеспечивается нормальное функционирование механизмов регуляции оогенеза in vivo. При этом необходимо понимать, что созревание ооцитов - это комплексный процесс, включающий в себя мейотическое преобразование ядра, цитоплазматическое созревание и преобразование мембраны. Поэтому, если для завершения ядерного созревания in vitro ооцитам достаточно обеспечить в средах энергетический и гормональный минимум, то цитоплазматическое созревание обеспечивается целым рядом биологически активных веществ, обеспечивающих в дальнейшем успешное оплодотворение яйцеклетки и развитие ранних зародышей до предимплантационных стадий. Также необходимо отметить, что системы культивирования, используемые в разных лабораториях, могут сильно отличаться как по типам и дозам гормонального и энергетического
субстрата, так и по типам основных питательных сред, объему культуральной среды и плотности ооцитов на единицу объема [2, 5, 7], а также использованию различных монослойных культур и клеток. Для культивирования ооцитов используют стандартные среды: ТС-199, Бринстера, Биггерса, ХЭМ-Ф-10, в которые добавляют сыворотки крови крупного рогатого скота или северных оленей, а также гормоны и другие, биологически активные вещества. Сыворотка крови, добавляемая в питательную среду в качестве биологически активной добавки для повышения выхода ооцитов со стадией развития метафаза-2 по некоторым данным, стабилизирует рН, оказывает антипротеолетическое действие и способствует более быстрой адаптации культивируемых объектов условиям культуральных сред. Кроме этого, сыворотка крови содержит компоненты, способствующие выживанию и развитию клеток, среди которых особое значение имеют полипептидные факторы роста (ППФР), а именно: инсулинеподобный фактор (ИФР), факторы роста эпидермиса (ФРЭ), тромбоцитов (ФРТ) и фибробластов (ФРФ). В настоящее время получены данные только о действии ППФР на процессы мейотического деления клеток.
На практике используется как сыворотка плодов теленка, так и сыворотка коров. Если фетальная сыворотка плодов коровы производится на коммерческой основе и ее качество контролируется производителем, то эстральная сыворотка получается в частном порядке от клинически здоровых доноров в тот же период полового цикла, что и возраст эмбриона или в период непосредственной охоты.
В своих исследованиях мы изучали эффективность использования сыворотки крови, полученной от коров, находящихся на разных стадиях полового цикла, добавляя ее в питательную среду по мере роста и развития эмбрионов, согласно их возраста, то есть в питательную среду с эстральной сывороткой (0 день) помещались зиготы. Эмбрионы, на вторые сутки после оплодотворения помещались в среду с сывороткой второго дня цикла и т.д.
По результатам исследований установлено достоверное превосходство второй и третьей групп клеток по выходу морул и бластоцист от числа оопитов поставленных на созревание по сравнению с контрольной - 41,6% и 48,4%, соответственно против 18,2% (Р<0,001). В том числе, по выходу бластоцист данный показатель превышал контроль на 7,0 и 9,8 % при Р<0,05 и Р<0,01, соответственно. Между второй и третьей группами достоверных различий не установлено.
Таким образом, использование в культуральных системах сыворотки крови от коров на разных стадиях полового цикла не снижает эффективности метода. Однако из-за достаточной сложности самой процедуры предпочтительней использовать сыворотку крови, полученную от коров в период охоты.
Как правило, кровь для получения сыворотки берется у животных во время спонтанного полового цикла, когда наличие и концентрация биологически активных веществ в ней отвечает физиологической норме животного на данный момент времени. Однако с разработкой методов гормональной регуляции полового цикла появилась возможность стимулировать активность фюиологических процессов в организме животного. Так, при гормональной обработке коров-доноров с целью вызывания множественной овуляции к росту стимулируется не один фолликул, как обычно, а несколько, что вызывает определенные сдвиги в гормональном фоне животного в сторону увеличения концентрации тех гормонов, которые непосредственно отвечают за фолликуло-и эмбриогенез - гормоны гипофиза, яичников, щитовидной железы и надпочечников. В связи с чем, встает закономерный вопрос об эффективности использования сыворотки крови от суперовулировавших коров-доноров в культуре in vitro при получении эмбрионов крупного рогатого скота.
В наших исследованиях донорами крови служили одни и те же животные, у которых была взята кровь на 0, 6 и 7 день спонтанного и стимулированного полового цикла. Нулевой день - это день охоты, шестой день - день, предшествующий
